Способ получения биологически активных веществ

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. сеид-ву (22) Заявлено 25. 06. 80 (21) 2950940/30-15 с присоединением заявки Hо— (23) Приоритет—

Опубликовано 301181. Бюллетень М 44

Дата опубликования описания 3011.81 («)885252 (51) м. кл.з

С 1? 8 9/00

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (53) УАК 581.143.6 (088. 8) (72) Авторы изобретения

И. В. Александрова, A. Н. Данилина, Л. В. Галкина и О.Л.Анисимов... НИЧА< (71) За яв ител ь

Всесоюзный научно-исследовательский биотехничМЙЭКЩ институт (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ

ВЕЩЕСТВ

Изобретение относится к технологии получения и выращивания пересадочных культур растительных тканей, например культуры ткани родиолы po=

I 5 зовой, используемых в качестве продуцентов биологически активных веществ в различнйх отраслях промышленности.

Известны способы получения биологически активных веществ из культуры растительных тканей, заключающиеся в обработке культуры растительной ткани химическими мутагенами с целью интенсификации процесса (обработки

К-нитрозометилмочевиной в концентра- 15 ции 0; 25"-О, 30 мМ) (11 и t2)

Известен также способ получения ..алкалоидов иэ культуры ткани Rauwol:f.1 э, заключающийся в том, что стери" льно йроращивают семена до обраэова- 20 нйя в пробирках проростков, на дисках из стеблевой части проростков индуцируют каллусообразование, а затем. каллус отделяют от первичного . эксплантанта и пересаживают на из- 25 мененную питательную среду, где он растет без признаков дифференцировки (неорганизованный рост) .

Алкалоиды выделяют по общепринятой для корней методике (3). 30

Недостатком известных способов является невысокий выход биомассы при двадцати шестидневном культивировании.

С целью получения родиолозидсодержащих веществ из культуры изолированной ткани была введена в куль-.уру родиола розовая.

Цель изобретения — повышение выхода биомассы и целевого продукта при сокращении срока культивирования.

Указанная цель достигается тем, что предварительно перед посадкой выросшую каллусную ткань родиолы розовой пересаживают на измененную питательную среду и растят на ней 25-

28 сут до заложения меристемы корне-. вых апексов.

Получение культуры ткани родиолы розовой осуществляют следующим образом.

Семена стерилизуют 0,1%-ным раствором сулемы.

Промывают в трех порциях стерильной дистиллированной воды.

Высаживают в среду Мурасиге и

Скуга следующего состава: макроэлементы по Мурасиге и Скугу; микроэле885252

60 менты по Мурасиге и Скугу; сахароза

2Ъ> агар-агар 0,6Ъ.

Стерилизацию среды проводят в автоклаве 0,8 атм 15 мин 105 С.

Семена проращивают в течение 11,5 мес на свету под люминесцентными лампами в термостатированных стерильных условиях до появления проростков 6-10 см высотой и диаметром стебля 1,2-1,5 мм в нижнем междоузлии.

В качестве первичного эксплантанта используют нижнее междоузлие. С соблюдением строгих правил асептики нижнее междоузлие разрезают на диски толщиной 1,5-2,0 мм. Диски помещают на питательную среду (2) следующего 15 состава, мг/л:

Макроэлементы по

Мурасиге и Скугу

Микроэлементы по

Мурасиге и Скугу 20

Сахароза,Ъ 2

Рибофлавин 1

Тиамин-хлорид 2

2, 4-Д 0,2

Аденин 0,2

Пиридоксин 1

F е-хелат 5

Са-пентатенат 1

Агар-агар,Ъ 0,6

На 60 день образовавшийся каллус отделяют от первичного эксплантанта и пересаживают на питательную среду того же состава. На ней каллус растят в течение 5-7 пассажей для его стабилизации. Продолжительность одного пассажа 40-45 дней. К концу пятого пассажа каллус переходит к неорганизованному росту, признаки морфогенеза исчезают.Каллус становится более светлым, количество темно-бурых участков заметно уменьшается, ис- 40 чезает серебристо-белый налет. Каллус плотный, агрегированный.

Выход биомассы составляет 150170 г/л по сырому весу. Количество родиолозида на абсолютно сухой вес (ACB)0i07-0i08o.

Для интенсификации процессов роста и выхода биомассы, а также выхода целевого продукта при одновременном сокращении сРоков выращивания, предла- 0 гается изменение компонентов питательной среды, обеспечивающее редифференцировку, ограничивая ее образованием меристемы корневых апексов.

Состав питательной среды, мг/л:.

Макроэлементы по

Мурасиге и Скугу

Микроэлементы по

Мурасиге и Скугу

Сахароза,Ъ 3

Тиамин-хлорид 1

Мезоинозит 100

АНУ 1

Аденин 0,1

Кинетин 0,1

Fe-хелат 5 65

На указанной выше среде каллусная ткань плотная, слабо оводненная,серовато-желтого цвета. Отдельные участки серовато-коричневые, каллус матовый. Микроскопический анализ

20-24-дневного каллуса обнаруживает закладку меристемы корневого апекса.Цикл выращивания каллусной ткани составляет 25-28 суток. Выход биомассы за этот срок культивирования

380-400 г/л по сырому весу и 14-15 г/л по сухому весу. КОличество родиолозида на ACB О,ЗЪ.

Из сухой биомассы готовят экстракт на 40 этиловом спирте. Соотношение сырье: экстрагент составляет

1:10. Экстракцию проводят в делительной воронке в течение одних суток.

Экстрактивные вещества, содержащие родиолозид, получают выпариванием настойки в вакууме при 55 С. Количество родиолозидсодержащих веществ в абсолютной сухой биомассе составляет

25Ъ.

Пример 1. Каллусную ткань родиолы розовой получают и выращивают на питательной среде Мурасиге и

Скуга следующего состава, мг/л:

Макроэлементы по

Мурасиге и Скугу

Микроэлементы по

Мурасиге и Скугу

Сахароза,Ъ 2

Рибофлавин 1

Тиамин-хлорид 1

2,4-Д 0,2

Аденин 0,2

Пиридоксин 1 е-хелат 5

Са-пентатенат 1

Агар-агар, Ъ 0,6

На этой среде ткань растет 40-45 дн. без признаков Морфогенеза. Выход биомассы составляет 150-170 кг/л по сырому весу. Количество родиолозида на АСВ 0,07-0,08Ъ.

Данная среда не обеспечивает достаточного выхода биомассы и целевого продукта.

Пример 2. Для обеспечения выхода целевого продукта испольэовали среду, .вызывающую редифференцировку, доведя ее до заложения меристемы корневых апексов.

Использовали среду Мурасиге и

Скуга со следующими добавками

Сахароза ЗЪ;2,5-3,5; 25-35 r

Тиаминхлорид 1 мг/л; 0,5-1,2

Мезоинозит 100 мг/л; 80-120

АНУ 1 мг/л, .0,8-1,1

Аденин О, 1 мг/л; О, О 8- О, 1 3

Кинетин 0,1 мг/л> 0,1-1,0

I е-хелат 5 мг/л; 4,5-5,5, Данная среда к 20-24 дню культивирования вызывает редифференцировку (заложение меристемы корневых апексов) . К 25-28 сут. выход био885252

Сырой вес составляет 380-400 г/л, сухой вес — 13-14 г/л. Количество родиолозида составляет О,ЗЪ íà ACB.

Наиболее оптимальным сроком культивирования являются 25-28 сут.

Формула изобретения

Составитель М.Мирзаев

Редактор С.Крупенина Техред С.Мигунова Корректор М.Коста

Заказ 10446/33 Тираж,531 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж -35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная,4 массы — 380-400 г/л, количество родиолоэида 0,3% íà ACB.

Для увеличения выхода биомассы и целевого продукта необходимо изме-. нить питательную среду, обеспечивающую закладку меристемы корневых апексов.

Пример 3. Каллусную ткань родиолы розовой пересаживали на питательную среду Мурасиге и Скуга со следующими добавками, мг/л:

Сахароза,Ъ 3

Тиамин-хлорид 1

Мезоиноэит 100

АНУ 1 бдении 0,1

Кинетин 0,1

Fe-хелат 5

На указанной среде ткань культи— вируют менее 25 сут. (до 23-х сут) .

За этот период ткань достигает фазы линейного роста, выхода на плато по 20 росту и накоплению биомассы не наблюдалос ь.

Культивирование ткани менее 25 сут нерентабельно.

Пример 4. Каллусную ткань 5 культивируют на среде, указанной в примере 2.

Время культивации более 28 сут (30-35 дн).

За этот период ткань достигает веса = 400 г/л, но при этом ткань оводняется, темнеет и появляется значительное количество некротических участков.

Культивирование более 28 сут нецелесообразно.

Пример 5. Каллусную ткань культивируют на среде, указанной в примере 2.

Время культивирования 25-28 сут.

За этот период ткань по росту и на- 40 коплению биомассы выходит за плато.

Способ получения биологически активных веществ, включающчй получение каллусной ткани на твердой питательной среде и экстракцию растворителем, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода биомассы и целевого продукта, предварительно перед посадкой каллусную ткань пересаживают на питательную среду Мурасиге и Скуга, которая дополнительно содержит, г/л:

Сахароза 25-35

Тиаминхлорид 0,0005-0,0012

Меэоинозит 0,8-1,2 альфа-Нафтилуксусная кислота 0,0008-0,0011 бдении 0,00008-0,000013 . Кинетин 0,00001-0,0001

Fe -хелат 0,0045-0,0055 и культивируют в течение 25-28 сут до заложения меристемы корневых апексов.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе.

1. Ковалева Т.A. Культура ткани . раувольфии змеиной. Автореф. канд. дисс. М., 1973.

2. Саркисова M.A. Культура ткани дискореи дельтавидной как продуцент, стероидных солонинов. Автореф.канд. дисс. N., 1973.

3. Патент Японии Р 52-20554, кл. С 12 К 9/00, 1977 (прототип).