Способ получения тафцина

 

Сеюэ Советсиии

Сециалистическии

Рвспублим.

O Il H C A H И Е щ891647

ИЗОБРЕТЕН Ия

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (6l ) Дополнительное к авт. с вид-ву (22)Заявлено 04.03.80 (21) 2890839/23 04 с присоединением заявки М (23)Приоритет (5!)М. Кл.

С 07 С 103/52//

А 61 К 37/02

УЬеуааротокниый комитет

CCCP аю делам иэобретеиий и открытий

Опубликовано 23.12.81. Бюллетень РЬ 47

Дата опубликования описания 23;12.81 (53) УДК 547.964: ,4.07 (088.8) Н. А. Самойлова, С. М. Андреев, О. М. Галкин и С. В. Рогожин (72) Авторы изобретения (7l ), Заявитель

Ордена Ленина институт элементоорганических соедийений

АН СССР (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТАФЦИНА

Изобретение относится к получению. биологически активного тетрапептида — тафцина, который стимулирует фагоцитозную активность лейкоцитов крови н может найти применение в медицине, Известны способы получения тафцина с использованием твердофаэного и классического методов пептидного синтеза, также с использованием полимерных активированных эфиров (11 — (3) .

Наиболее близким к предлагаемому по тех10 нической сущности является способ получения тафцина, основанный на основании полимерных активированных эфиров N-защищенных e — аминокислот (4). Согласно этому методу нераст15 воримый полимерный алкилированный эфир

l, полученный иэ N-защищенной аминокислоты и полимера--активатора, коцпенсируют с эфиром а -аминокислоты, содержащим свободную и— аминогруппу II. Образующийся при этом защищенный дипептид 1Н переходит в раствор, а иэ. быток непрореагировавшего полимерного активированного эфира N-защищенной а-аминокислоты и полимер-активатор 1Ч удаляют фильтрацией. После удаления N--концевой аминозащитной группы дипептида операцию повторяют до получения желаемого пептида с заданной аминокислотной последовательностью .

I Х вЂ” NH-CHR — СОО-P+ HqN-CHR — СООТГ»

Н

Х вЂ” NH — CHR- ONH — CHR -СООУ + P— - ОН

Щ ЪЧ где Х вЂ” аминозащитная группа;

У вЂ” карбоксилзащитная группа;

Р— полимер-активатор.

Однако используемые в известном способе полимерные активированные эфиры на основе сополимера стирола с 2% днвинилбенэола являются гидрофобными полимерами, т, е. практически не набухают в водной среде и практически не реагируют с водорастворимыми аминокомпонентами, и, в частности, со свободным

1.-аргииином и пептидами, содержащими свободный I аргинин. По этой причине синтез ведут в среде органического растворителя с использованием и -защищенного эфира L-аргинина.

891647

Использование N -защищенного эфира L aPгинина приводит к значительному увеличению себестоимости конечного продукта, и, создает большие трудности на стадии деблокирования защищенного конечного тетрапептида. 5

Для полного удаления N — N0, -защитнои

6 группы аргинина необходимо использовать безводный фтористый водород, который является очень токсичным соединением, и для работы с которым необходимо специальное оборудова- 10 ние (5). Кроме того, использование органических растворителей в качестве среды для синтеза также увеличивает себестоимость конечного продукта.

Указанные недостатки приводят к усложнению t5 процесса и повышению себестоимости конечного продукта и делают этот метод малопригодным для крупнотонного производства тафцина.

Цель изобретения — упрощение способа получения гафцина. 26

Поставленная цель достигается способом получения тафцина последовательным наращиванием пептидной. цепи в присутствии гидрофильных поли-N-оксисукцинимидных эфиров общей формулы 25

Х вЂ” А — P где Х вЂ” трет.: бутоксикарбонилгруппа;

Ф - - Р 0 L - 4 (В-; g — ТК г;

-- R-— о gg

О

- О- НОгде R — остаток N-винилпипролидона;

П

R" — - 4,4 -диаминодифенилоксида;

R - остаток стирола;

2. и процесс ведут в водной среде в интервале рН 8 — 10.

Предлагаемый способ позволяет проводить синтез тафцина с использованием свободного

С-концевого Л-аргинина, что значительно упропгает и удешевляет весь процесс. Использование свободного Л-аргинина позволяет исключить стадию деблокирования конечного тетрапептида безводным втористым водородом. Последнее обстоятельство имеет особенно большое значение для промышленного производства тафцина, так как фтористый водород является очень ток- 55 сичным соединением и работа с ним требует специального оборудования. Кроме того, замена органического растворителя на водную среду дает большой экономический эффект и снижает пожароопасность всего процесса, Исходные поли- N- оксисукцинимидные эфиры

N-защищенных а-аминокислот получают известным методом смешанных ангидридов из N-защищенной а-аминокислоты и поли- N-оксисукцинимидного гидрофильного полимера-активатора (6). В свою очередь полимер-активатор получают сшиванием диамином смеси сополимера малеинового ангидрида с N-винилпирролидоном и сополимера малеинового ангидрида со стиролом с последующей обработкой гидроксиламином (7) .

Пример 1. N-трет.-Бутилоксикарбонил- L-пролил-1 -аргинин.

К раствору 2.26 r (13 ммоль) 1-аргинина в 10 мл воды прибавляют при перемешивании

2,1 r (13,8 ммоль) поли-М-оксисукцинимидного (ПОС) эфира N-трет,-бутилоксикарбонил-) -пролина, Реакционную смесь перемешивают

48 ч при рН-9,0. Протекание процесса контролируют с помощью тонкослойной хроматографии на пластинах "Силуфол". Затем избыток непрореагировавшего ПОС эфира N-трет.-бутилоксикарбонил-1-пролина и полимер-активатор отфильтровывают, промывают водой (2 раза по

IS мл), метанолом (15 мл). Объединенный фильтрат упаривают в вакууме. Остаток промывают этанолом (20 мл), этилацетатом (20 мл) серным эфиром (20 мл), отфильтровывают и сушат.

Выход 4,10 r (82%), белое кристаллическое вещество. Т, пл. 178 — 185, (а) — 48,8 (с. 1, МеОН).

R — 0,78 (н-бутанол- пиридин-уксусная кислота — вода 10:5:4:4), R — 0,43 (н-бутанол-н-пропанол-вода- хлоруксусная кислота 65:15:20:3) (ТСХ на пластинках "Силуфол", ЧССР).

Найдено, %: С 49,44; Н 7,97; и 18,00

C> sIIs y N s 0s Н О

Вычислено,%: С 49,36; Н 7,97; N 17,99

Пример 2, N -трет-БутилоксикарбоС(, нил- N - бензилоксикарбонил-1 -лиз ил- L-пролил- 1.аргинин.

К 140 г (3,64 ммоль) N-трет.-бутидоксикарбонил-1-пролил-L-аргинина (см. пример 1) растворяют в 5 мл трифторуксусной кислоты, выдерживают 25 мин при комнатной температуре и упаривают в вакууме. Остаток промывают серным эфиром (3 раза но 20 мл) и растворяют в 25 мл воды. К полученному раствору прибавляют 5,8 r (5,7 ммоль) ПОС

ol эфира N -трет.-бутилоксикарбонил-N -бензилоксикарбонил- L-лизина. Реакционную смесь перемешивают 30 ч при рН 8,4, контролируя протекание реакции с помощью ТСХ. Затем полимер отфильтровывают, промывают водой

5 89 (2 раза по 20 мл) и метанолом (3 раза по

20 мл). Объединенный фильтрат упаривают в вакууме, Остаток промывают серным эфиром (3 раза по 20 мл) и суспендируют в воде, рН суспензии доводят до 3,5 и экстрагируют этилацетатом (2 раза по 20 мл). Водный слой отделяют, насыщают хлористым натрием и вы-: павший при этом маслянистый осадок отделяют, сушат в вакууме и затирают с серным эфиром.

Образовавшийся твердый осадок отфильтровывают и сушат в вакууме.

Выход 1,48 г (61%), белое аморфное вещество. Т размягчения 110, (а)р — 43,0 о о о (с. 1, МеОН). Rg — 0,50 (н-бутанол-н-пропанол-вода-хлоруксусная кислота 6S:15:20:3), R =

0,36 (этилацетат-пиридин-уксусная кислота -вода

1:1:1:1) (ТСХ).

Найдено,%: С 55,20; Н 7,60; М 15,10

c3pH47N7 ОЬ Н2О

Вычислено,%: С 55,23; Н 1,58; N 15,04

Аминокислотный анализ: уа 0,96; Рго 1,00;

Агд 0,94.

Пример 3. N-трет-Бутилоксикарбонил- L-треонил-М -бензилоксикарбонил-1-лизил-1Е

-пролил-1 -аргинин.

0,58 г (0,89 ммоль) N -трет,-бутилоксикарбонил- N -бензилоксикарбонил- L-лизил-1 -пролил-L-аргинина (см. пример 2) растворяют в

5 мл трифторуксусной кислоты, выдерживают

30 мин и упаривают в вакууме. Остаток промывают серным эфиром (2 раза по 15 мл). растворяют в 10 мл воды. К полученному раствору прибавляют 2,0 г (2,5 ммоль) ПОС эфира N-трет.-бутилоксикарбонил-1 -треонина. Реакционную смесь перемешивают 8 ч при рН 8,0.

Затем полимер отфильтровывают, промывают метанолом (20 мл) и ацетоном (20 мл). Остаток растворяют в 5 мл метанола и осаждают

10 мл серного эфира. Осадок отфильтровывают

IIpoMbIBsIoT серным эфиром (10 мл) и сушат в вакууме.

Выход 0,56 r (84,3%), белое аморфное соединение.

fe ) = — 37,8 (с. 1, МеОН). R,g = 0,40 (этилацетат-пиридин-уксусная кислота-вода

1:1:1:1) (ТСХ).

Найдено,%: С 54,10; Н 7,47; N 14,56

С44Н34МЬОI P ° Н30

Вычислено,%: С 54,24; Н 7,50; N 14,89

Аминокислотный анализ: Thr 1,01; Lys

0,98; Pro 1,00; Arg 0,98

Пример 4, N-трет-Бутилоксикарбонил- L-треонил- 1.-лизил- L-пролил- 1 -аргинин.

0,372 г (0,50 смоль) N-трет.-бутилоксикарбонил- 1.-треонил-é -бенэилоксикарбонил- L-лизил-1=пролил-L-аргинина (см. пример 3) растворяют в смеси 10 мл метанола и 1 мл уксусной кислоты, добавляют 0,2 r 5%-ного палладия на угле и перемешивают в атмос1647 6 фере водорода в течение 6 ч. Затем катализатор отфильтровывают, а фильтрат упаривают в вакууме. К остатку прибавляют смесь 2 мл серного эфира и 2 мл этилацетата,.тщательно перемешивают, осадок отфильтровывают, промывают серным эфиром (S мл) и сушат в вакууме.

Выход 0,29 г (94%), белое аморфное соединение. (а) =- 59,0о (с.1, МеОН)., © Rg= 0,92 (изопропанол-пиридин-уксусная кисло. та-вода 10:5:4:4);

R g —. 0,72 (н-бутанол-уксусная кислота-пиридин-вода 30:6:20:24);

R g = 0,68 (иэопропанол-пиридин-вода

4 $4: 1: l) (ТСХ) .

Найдено,%: С 50,61; Н 8,14; N 18,12

С 2ьН4ьйь06 Н30

Вычислено,%: С 50,47; Н 8,14; N 18,12.

Аминокислотный анализ: Thr 0,99; Lys 1,01;

20 Pro 1,00; Arg 1,03.

Пример 5, Три-трифторацетат4-треонил- L-лизил-1 -пролил- L-аргинина.

0,236 г (0,381 ммоль) N-трет.-бутилоксикарбонил- L-треонил-1 -лизил- L-пролил-1 -аргинина

И (пример 4) растворяют в 2 мл трифторуксусной кислоты, выдерживают 1 ч и добавляют

20 мл серного эфира. Образовавшийся осадок отфильтровывают, промывают. серным эфиром (20 мл) и сушат в вакууме.

30 Выход 0,317 r (98%), белое аморфное соединение. (а) = 32,2 (с.1, МеОН).

Rg = 0,29 (изопропанол-пиридин-уксусная кислота-вода 1: S:4:4);

Rg = 0,22 (н-бутанол-уксусная кислота- пиридин-вода 30:6:20:24) (ТСХ).

Найдено,%: С 38,41; Н 5,38; N 13,30

С2 Н4о йь Оь ЗСЕЗСООН Н30

Вычислено,%: С 38,39; Н 5,37; И 13,27.

Аминокислотный анализ: Thr 1,01; Lys

1,02; Pro 1,00; Arg 0,99..

Как видно из приведенных примеров, предлагаемый способ позволяет получать промежуточные и конечное соединения с достаточно высоким выходом (общий выход — 41%) без дополнительной очйстки, заменить дорогие и труднодоступные . производные N) — NO> — 1 — аргинина на дешевый и доступный свободный

1:аргинин, исключить иэ процесса получения тафцина стадию деблокирования защищенного конечного тетрапептида с помощью фтористого водорода, исключить использование на стадии конденсации органического растворителя.

Формула изобретения

$$

Способ получения тафцина путем последовательного наращивания пептидной цепи с исполь, зованием полимерных активированиьтх эфиров

891647

Составитель Г. Желтухина

Техред С.Мигунова.Редактор Р. 1Ьцика

Корректор В. Синицкая

Заказ 11140/32 Тираж 446

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Филиал НПП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Й-защищенных а-аминокислот с последующим опцеплением защитных групп и выделением юлевого.соединения, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве полимерных активированных эфиров

Н-защищенных. а аминокислот используют гидрофилъные поли-N-оксисукцинимидные эфиры общей формулы

Х вЂ” А — P где Х вЂ” трет:бутилоксикарбонилгруппа;

Д-l. -Рс(7;Е-1 Щ; p I-ф ! где и — остаток М-винилпирролидона;

R — 4,4 -диаминодифенилоксида;

R — остаток стирола, g и процесс ведут в водной среде в интервале рН 8-10.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Najjar Ч.А., Nishioka К. Tuftsin А na—

tural phagocytosis stimulating peptide.—

S "Nature", 1970, ч. 228, р. 672.

2. Chaudhuri M.Ê., Najjar Ч. А. Зо1Ы-pha—

se tuftsin (Thr-Lys-Pro-Arg) synthesis:depro—

taction and resin c1eavage with trif1uoromethane su1foriic acid.— "Ana1.8fochem." 1979, v. 95, р. 305.

3. Патент США 1Р 3778426, кл. С 07 С 103/52, 1973.

4. Fridkin М., Stabinsky Y., Zakuth V., Spirer Z. Tuftsin and some ana1ogs. Synthesis

1% and interaction with human ро1уеогрЬопос1еаг

1eucocytes.— "Siochem., 8iophys. Acta", 1977, v. 496, N 1, р. 203 — 211 (прототип).

5. Дж. Стюарт, Дж, Янг. Твердофаэнь и синтез пептидов. М., "Мир", 197!.

2й 6. Рогожин С.В., Давидович Ю. А., Самойлова Н. А., Миронова Н. В., Вртанов А. И., Андреев С. М. Синтез полимерных N-окснсукцинимидных эфиров И-замещенных аминокислот и пептидов,— Известия AH СССР". Серия

25 химическая, 1975, И 2, с. 428 — 433.

7. Авторское свидетельство СССР й"- 644800, кл. С 08 F 222/06, 1979.