Способ определения протеолитической активности в тонкой кишке

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Соцналнстнческнк

Республик (п>906522 (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 27 ° 10 80 (g1) 2998970/30-15 с присоединением заявки М (5! )М. Кд.

A 61 В 10/00

Гооуаарстееный комитет

СССР ао делен изобретений и открытий (23) Приоритет—

Опубликовано 23.02. 82 Бюллетень М 7 (53) УДК 543.9:

:543.43 (088 ° 8) Дата опубликования описания 25 02 82

1

И «Ф, ° 114 т (72) Автор изобретения

P.Ô. Акимова 1АТ ь rs, 1

TFXH89 ф;1 :, Институт медицинской паразитологии и тропической .айь и {л ° i медицины им. Е.И. Марциновской (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ

АКТИВНОСТИ В TOHKOH КИШКЕ

Изобретение относится к медицине, конкретно к экспериментальной и клинической физиологии и касается оценки функционального состояния тонкой кишки, что имеет значение для изучения патогенеза любых болезней желудочно5 кишечного тракта, в частности лямблиоза.

Известен способ определения протеолитической активности в тонкой киш10 ке, включающий отмывание ее с последующей инкубацией отмыва с субстратом и колориметрирование 1 1 1.

Недостатком способа является невозможность определения общей протеолитической активности полостного и пристеночного пищеварения белков по всей длине, большой расход субстрата и трудность его приготовления °

Цель изобретения — определение общей протеолитической активности.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве субстрата используют отфильтрованный 1-2,51 раствор казеина, причем соотношение объема субстрата к весу кишки равно 1:(20-40) °

Пример 1. Опыты были проведены на 46 беспородных белых мышах.

Вес животных к началу опыта был

7-10 грамм. 24 мьппи были заражены взвесью трофозоитов лямблий, полученных из кишки спонтанно зараженных мьппей. Контролем служили 22 животных той же партии, не зараженные лямблиями.

Определение протеолитической активности у мьппей начинали проводить с 7 дня после их заражения лямблиями. Животных забивают вытяжением шейного отдела позвоночника. В течение полутора месяцев ежедневно вскрывают по одному животному, чередуя опытных и контрольных. После вскрытия брюшной полости быстро извлекают тонкую кишку, делят ее на 4 равные части и от копна каждой из частей берут для исследования по сегменту весом 80 — 16Q мт . Опре

906522

Казеин не фильтрованный

Казеин фильтрованный

20,0

0,15

99,2

0,5!

0,53

2,5

2,0

103,6

0,51

0,52

99,2

101,4

1,5

110,2

0,56

1,0

0,40

75,0

0,5 деление протеолитической активности проводят в пяти фракциях (С Д, Д, Д. и Г), полученных от одного и того же сегмента кишки. Фракция

С характеризует количество фермента, находящегося в полости кишки и служит показателем полостного пищеварения. Активность фракций Д„, Д, Д отражает количество адсорбированных протеаз на поверхности 10 слизистой оболочки. Фракция Г характеризует количество внутриклеточных протеаз. Суммарные фракции Д и Г считаются показателями состояния пристеночного пищеварения. 15

Для получения фракций один и тот же сегмент тонкой кишки встряхивают на Шуттель-аппарате, перенося его последовательно в четыре одинаковых по объему порции холодного раствора Рингера (рН 7,4). Фракцию

С получали встряхиванием кусочка в течение 30 с. а фракции Д вЂ” по три минуты каждая. По окончании экстракции кусочек взвешивают и 25 растирают в фарфоровой ступке. К гомогенату добавляют 4 мл раствора

Рингера. Все полученные растворы центрифугируют при 5000 оборотов в течение 10 мин. В надосадочной жидкости определяют активность про—

Пример 3. Далее были испытаны различные концентрации фильтрата казеина с целью снижения количества использованного субстрата. теаз по приросту свободного тирозина, освобождающегося под влиянием протеаз во фракциях, не осаждаемых трихлоруксусной кислотой. Субстратом служит 1Х фильтрованный раствор казеина на фосфатном буфере. 1 мл

его инкубируют с 1 мл надосадочной о жидкости при 37 С в течение одного часа.

Активность фермента определяют колориметрически по окраске протеаз реактивом Фолина и оценивают по калибровочной кривой, выражая в мкг тирозина на 1 мг веса кишки за 1 ч инкубации.

Пример 2. Приготовляют 2,57 раствора казеина на фосфатном буфере (рН 7,4), при этом получают взвесь казеина. При использовании этой взвеси наблюдается невысокая протеолити- . ческая активность даже при применении чистого кристаллического трипсина, тогда как при использовании фильтрата того же раствора наблюдалась более выраженная протеолитическая активность, В табл. 1 приведены данные протеолитической активности кристаллического трипсина при использовании различных растворов казеина.

Таблица 1

В табл. 2 приведены данные протеолитической активности кристалличес— кого трипсина с различными концентрациями казеина.

Таблица 2

906522

Формула изобретения

Составитель Л. Рубинова

Редактор Т. Киселева Техред М. Тепер Корректор М. Шароши

Заказ 446/7 Тираж 717 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035> Москва Ж-35 Раушская наб.z д. 4/5

Филиал ППП Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Как видно из табл. 1 и 2 выраженная протеолитическая активность наблюдалась при использовании 1,02,5Х-ого раствора казеина. В опытах мы использовали l -ный раствор фильт- 5 рованного казеина.

Таким образом, изобретение позволяет оценивать общую протеолитическую активность в полости кишки, на поверхности слизистой оболочки и в ее гомогенате по всей длине тонкой кишки у экспериментальных животных, Это позволяет по сравнению с известным ранее оценивать участие протеоли-1 тических ферментов в полостном и при- 5 стеночном пищеварении по всей длине тонкой кишки и обеспечивает получение сведений об изменении скорости переваривания белков в различных участках тонкой кишки при лямблиозе. На 20 основании полученных данных можно судить о степени вовлечения в патологический процесс как самой тс нкой кишки, так и других органов и систем. принимающих участие в процессе переваривания белков.

Способ определения протеолитической активности в тонкой кишке, включающий отмывание ее с последующей инкубацией отмыва с субстратом и колориметрирование, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью определения общей протеолитической активности, в качестве субстрата используют отфильтрованный 1-2,5Х-íûé раствор казеина, а соотношение объема субстрата к весу кишки равно 1:(20-40).

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Теоретические и прикладные ас-. пекты Мембранного пищеварения, 1978, 144-147.