Питательная среда для выделения патогенных нейссерий

 

Союз Советскии

Социапистическии респубики

О П И С А Н И Е (щ907069

И ЗОБ РИТЕ Н-ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВКДДТИЛЬСТВУ (6l ) Дополнительное к авт. саид-ву (22)Заявлено 06. 06. 80 (21) 2936517/28-13 с присоединением заявки М (23) Приоритет

Опубликовано23.02.82. Бюллетень М 7

Дата опубликования описания 23.02.82 (51)M. Кд.

С 12 N 1/20// (C 12 и l/20

С 12 R 1/363

1осударствапай комитет

СССР по делам изобретений и атярытий (53) УДК 576.8.

" М&3.31 (088. 8) t (А.Г.Гаджиева, Н.Н.Костюкова и P ° О.Алие а

Дагестанский научно-исследовательский институт"

- -т -- 1 по производству питательных сред и Научно-исследовательский ордена Трудового Красного Знамени институт эпидемиологии и микробиологии им. почетного акад. Н.Ф.Гамалеи ANH СССР (72) Авторы изобретения (71) Заявители (54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ

11АТОГЕННЫХ НЕЙССЕРИЙ

Изобретение относится к медицин = нской микробиологии и касается питательной среды, которая может быть. использована для выделения патогеннык нейссерий: менингококка, гонококка от больных и носителей, а также для культивирования этих микроорганизмов и изучения их культурально-биохимических и серологических свойств.

Известна питательная среда для выделения патогенных нейссерий; содержащая питательную основу сыворот1 ку крови, агар-агар и воду (1 ).

Однако известная питательйая среда не обеспечивает высоких ростовых свойств.

Цель изобретения — повышение ростовых свойств среды.

Эта цель достигается тем, что нитательная среда для выделения патогенных нейссерий, содержащая питательную основу, сыворотку крови, агар-агар и воду, дополнительно содержит аммонийную соль 5,5 дибромвЂ.о-крезолсульфофталеина, в качестве питательной основы она содержит казеиново-дрожжевой гидролизат при следующем количественном соотноше5 нии компонентов, г/л воды:

Казеиново-дрожжевой гидролизат 40,8-44,0

Сыворотка крови 100,0-200,0

Аммонийная соль

5,5 дибром-о-крезолсульфофталеина - 0,005-0,014

Агар-агар 10,2-11,0

Среду готовят следунщим образом.

l5

Получение сухого казеиново-дрожжевого.гидролизата.

2 вес.ч. сухого казеина смешивают с 20 ч. воды. Разведение казеина ведут при постоянном перемешивании и температуре 70-80 С, при рН=8,4. Затем lOX-ный вязкими раствор казвина охлаждают до температуры о

48-50 С и вносят в него по одной части кормовых дрожжей и фарша подже3

9 лудочной железы (активностью 20 ед/мл по Фульд-Гроссу) . После тщательного перемешива.ma устанавливают рН 7,27,4 с помощью 30%-ного раствора едкого натрия. Ферментативный гидролиз проводят в течение 4 ч при темперао, Э туре 48-50 С и при рН 7,2-7,4.

После истечения указанного времени гидролизат подкисляют концентрированной соляной кислотой (уд. вес.

I,14) до рН3,6-3,8, затем доводят до кипения и фильтруют. После этого кислый гидролизат подщелачивают до рН 7,6-7,7, кипятят 10-15 мин и проводят вторую фильтрацию. В полученный фильтрат вносят хлористый натрий и углекислый натрий (80X и 13,4Х соответственно, к содержанию сухих веществ в гидролизате). После раст-, ворения внесенных солей гидролизат фильтруют и при температуре бО С высушивают на распылительной сушилке.

Приготовление сухой основы среды.

В шаровую трехлитровую мельницу помещают 10 фарфоровых шаров, затем вносят 10,2-11,0 r тафуинского порошковидного агар-агара с прочностью 400-500 г/см, 40,8-44,0 r. сухого казеиново-дрожжевого гудролизата и 0,005-0,014 г аммонийной соли 5,5 дибром-о-крезолсульфофталеин добавляют еще 15 фарфоровых и 1 металлический шар.

Мельницу закрывают и прокручивают в течение 25-30 мин. Готовую основу расфасовывают.

Приготовление среды.

Навеску сухой основы 51-55 г перемешивают в IООО мл дистиллиро40 ванной воды, ставят на медленный огонь, кипятят до появления крупных пузырей и разливают в склянки, автоо клавируя при 115 С в течение 2030 мин. Затем основу остужают до

40-45 С и добавляют нормальную лошадиную или бычью сыворотку, 1015Х для менингококка и 207 для гонококка, перемешивают и разливают по 20-25 мл в чашки Петри и по 5 мл в пробирки (для скошенного агара).

Среда имеет светло-зеленоватый цвет.

Содержание всех вышеперечисленных ингредиентов в среде в следующем соотношении, г/л:

Казеиново-дрожжевой гидролизат 40,8-44,0

Агар-агар 10,2-1},0

Таблица 1

900

171

СЙ-4937

70 среднее арифметическое количества колоний на 5 агаровых пластинах в двух опытах

Приведенные в табл. 1 данные показывают, что предлагаемая среда (КДА) является более оптимальной ля развития менингококка, чем агар "D", Так, при коэффициенте вариации (Y) >

55 не превышающем 20Х, средняя арифметическая (X) числа выросших колоний двух штаммов менингококка на предложенной среде составляет 11170б9

Сыворотка лошадиная или бычья 100,-0-200,0

Аммонийная соль

5,5-дибром-о-крезолсульфафталеина 0,005-0,014

Дистиллированная вода Остальное (что дает кислотность рН - 7,2-7,4)

Среда в чашках Петри и в пробирIp ках используется для посева первичного материала, подозреваемого на содержание менингококка в спинно-мозговой жидкости от больных менин-, гитом и носоглоточной слизи носителей, или гонококка в отделяемом из уретры и шейки матки от больных с подозрением на гонорею, для культивирования и изучения чистых культур этих микроорганизмов.

gp Пример 1. 0,1 мл взвеси менингококка или гонококка, содержащей условно 10 микробных клеток (по кишечному стандарту ГИСК) наносят на поверхность 5 чашек 1!етри с сывороточным агаром, приготовленном на предложенной среде. Для контроля делают посев на известную среду для менингококка или мясо-пептонный агар с добавками для гонококка.

Учет результатов производят через

20-24 ч инкубации при 37 С.

Сравнительное испытание сред для менингококка приведено в табл. I.

5 907069

171 колоний, тогда как известная среда — агар "0" обеспечивает рост колоний в пределах 70-82. При сравнении полученных данных разница оказалась значимой,(t > 2) в пользу предлагаемой среды.

Как видно из данных табл. 2, на предложенной среде средняя арифметическая выросших колоний превышает таковое на. известной среде—

4 сывороточном мясо-пептонном araре с добавками. При посевной дозе

1000 микробных клеток на предложенной среде вырастает. 112-276. колоний, известной - 107-185 колоний.

Разница между средними показателями сравниваемых сред оказалась значимой в пользу предложенной среды (штамм Богомолов), для штамма 2 среды оказалась равнозначной. В табл.2 20 приведено сравнительное испытание сред для выделения гонококка.

Таблица 2

276

185, Богомолов

112

107 формула изобретения

Пример 2. 220 проб носоглоточной слизи от лиц, бывших в контакте с больными менннгококковым менингитом, параллельно высевают в чашки

Петри на предложенную и известную среды. При посеве чередовались. Всего выявлено 90 носителей. На предложенной выявлено 88 положительных находок, а на известной всего 48, 45 причем совпадений на обеих средах было 46. Предложенная среда дала

47,7Х дополнительно положительных находок к известной среде.

Пример 3 ° 35 образцов гноя

50 из уретры и шейки матки от больных с подозрением на острую. гонорею параллельно засевают на предложенную и известную среды. Пробирки с засеянными средами помещают в эксикатор, содержащий 5-7Х углекислого

55 газа.

Из 35 посевов одновременно на опытной и контрольной средах было получено 27 совпадающих положительных находок. Предложенная среда обеспечила дополнительно еще 4 положительных результата.

Пример 4. Штаммы менингококка, подлежащие серологическому группированию, параллельно культивируют в пробирках на предложенной и известной средах. 26 культур менингококка были испытаны на их способность агглютинироваться (PA) группоспецифическими антисыворотками и в реакции преципитации (РП) на со- держание группоспецифического полисахаридного антигена.

В РП удалось определить серогруппу у 19 штаммов, причем у 14 из них на обеих средах результаты группирования совпали, у 4 штаммов серо-группу определяют во взвеси культуры, выращенной на предложенной и только у 1 — на известной. В PA удалось группировать 20 культур, в ll случаях совпали результаты на двух средах, в 5 — с опытной среды и в

4 — только с контрольной.

Следовательно, культуркрование штаммов менингококка на предложенной среде не снижает их способность группироваться антисыворотками в

РА и РП по сравнению с культурами, выращенными на известной среде °

Пример 5. Сахаролитические свойства менингококка и гонококка на предложенной среде с добавлением сыворотки, 0,97 углеводов (глюкоза, мальтоза, сахароза, левулеэа), и фенолово-красного индикатора проявлялись более четко, чем на контрольных средах того же состава, но приготовленных на основе перевара Хоттингера или агара "0" для менингококка и мясо-пептонном arape с добавителями для гонококка.

Преложенный способ позволяет повысить ростовые свойства среды.

Общая экономическа„я.эффективность при выпуске предлагаемой среды взамен сред, рекомендуемых практически лабораториям для выделения менингококка и гонококка составит 237250 руб

Питательная среда для выделения патогенных нейссерий, содержащая питательную основу, сыворотку крови, агар-агар н воду, о т л н ч а ю907069

40,8-44,0

Составитель С.Малютина

Редактор Г.Волкова Техред М. Рейвес Корректор Л.Бокшан, Заказ 519/34 Тираж 505 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал 1ПП1 Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 щ а я с я тем, что, с целью повышения ростовых свойств среды, она дополнительно содержит аммонийную соль 5;5 дибром-о-крезолсульфофталеина, в качестве питательной основы она содержит казеиново-дрожжевой гидролизат при следующем количественном соотношении компонентов, г/л воды:

Казеиново-дрожжевой гидролизат

Сыворотка крови 100,0-200,0

Аммонийная соль

5-5 дибром-о-крезолсульфофталеина 0,005-0,014

Агар-агар 10,2-11,0

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М., "Медицина", 1972, с. 447, пр. 26.