Способ получения ферментного препарата,обладающего уреазной активностью

 

Союз Советскик

Социапистичвсиик

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (6l ) Дополнительное к авт. саид-ву(22)Заявлено 12.05. 80 (21) 2923885/28 13 с присоединением заявки М(23) ПриоритетОпубликовано 28 02 ° 82. Бюллетень Рй 8

Дата опубликования описания 28.02.82 (5c)h%. Кл.

A 61 K 35/78

Гееудеретесн«ыМ квинтет

CCCP не делен «зебретеннй н еткрытнй (53) УЙК615. 45: -615 7.577

° 155 33(088.8) С.И.Дихтярев, В.Т.Чернобай, M.M.ßíèíà, Б.И.Курганов и В.В.Тимофеев (72) Авторы изобретения

Харьковский научно-исследовательский хими офармацевтический институт (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ фЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА, ОБЛАДАЮЩЕГО УРЕАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается технологии получения ферментных препаратов.

Известен способ получения ферментного препарата, обладающего уреазной активностью, путем измельчения семян арбуза сорта "Любимец хутора Пятигорский", экстрагирования сырья водой при рН 6,9-7,2 и 18-25 С и очистки полученного экстракта ацетоном с последующим выделением целевогоепродук- 1!).

Однако известный способ не обеспечивает получение ферментного препарата с высокой уреаэной активностью (на 1 г препарата 350-450 ед. Самнера).

Цель изобретения — расширение сырьевой базы и повышение уреазной активности целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что в способе получения ферментного препарата, обладающего уреазной активностью, включающем измельчение семян арбуза, их экстрагирование при рН 6,9-7,0 и температуре 18-25 С, очистку гюлученного экстракта и выделение целевого продукта, в качестве исходного сырья используют измельченные семена арбуза сорта "Огонек" вида Cltruilus Vulgares Sohrad, экстрагирование проводят фосфатным буфером при соотношении сырье-экстрагент

1В, .

1:3-1". 4 и очистку полученного экстракта осуществляют насыщенным раствором аммония сульфата, а затем этанолом при соотношении этанол-раствор

115-125

Сгюсоб осуществляется следующим образом.

2 кг измельченных на вальцах семян арбуза сорт "Огонек" загружают

20 в экстрактор и экстрагируют 7 л О, 1 И калий-натриевого фосфатного буфера рН 6, 8-7, О приготовленного на дистиллированной воде, содержащей 10 M

ЭДТА (этилендиаминтетранатриевой со3 908359 ли уксусной кислоты) и 10 M Ъ -меркаптоэтанола в течение 1 ч 50 мин при 22-24 С. После освобождения экстракта от муки центрифугированием при 4 С с частотой вращения ротора

3000 об/мин (2600 g) в полученных

5,8 л экстракта проводят первичное осаждение белков насыщенным раствором аммония, сульфата, добавляя последнего 3,87 л. После отстаивания 1в в течение 6 ч образующийся осадок в отделяют центрифугированием при 4 С с частотой вращения ротора

3000 об/мин (2600 g), а к надорадочной жидкости вновь добавляют 1,93 л 15 насыщенного раствора аммония сульфата. Оставляют для отстаивания в течение 10 ч. Затем осадок белка, содержащий активный фермент, растворяют в 200 мл воды, охлаждают до +10 С и осаждают этиловым спиртом о в соотношении раствор-этиловый спирт

1:2. Оставляют для образования осадка на 2 ч. Затем осадок отделяют центрифугированием при 4 С с частотой вращения ротора 3000 об/мин в течение 10 мин. Насадочную жидкость сливают, а осадок растворяют в дистиллированной воде, замораживают при

-40 С в течение 2 ч и высушивают суб- о лимацией в глубоком вакууме с темпео ратурой на противне +30 С в течение

8 ч. Уреазная активность полученного продукта составляет 1500 ед. Самнера на 1 л препарата или 120 мкмоль мочевины в 1 мин на 1 мг белка.

Полученный ферментный препарат представляет собой белый аморфный порошок, растворимый в воде, фосфатном буферном растворе рН 7,0-7,4.

Продолжение табл.1

Соотношение сыУрезная активность в единицах амнера/

/1 г белка рья и экстрагента

283 3

211,9

184, 7

1:3,5

1:3,0

1:2 5

В табл.2 представлена зависимость уреазной активности от степени насыщения экстракта сернокислым аммонием.

Таблица 2

Уреазная активность в ед. Самнера на

1 г белка

30

26000

40

50000

42 5

90000

100000

47,5

60000

60

40000

Таблица 1

Уреазная активность в единицах самнера/

/1 г белка

Соотношение сырья и экстрагента

Уреазная активность в ед на 1 г белка самнера

Соотношение этанол — раствор

165

1:5,0

1:4,5

1:4,0

190, 1

250,5

96200

190500

1:1,5

В табл.1 представлена зависимость уреазной активности от соотношения сырья и экстрагента.

В табл. 3 представлена зависимость уреазной активности от соотношения этанола и раствора целевого продукта, Ъ

Таблица 3

5 908359

Продолжение табл.3 а

Формула изобретения

Соотношение этанол — раствор

Урезная активность в ед на 1 r белка амнера

1:2,0

1:2,6 о

1:3 0

170400

Составитель В.Брусиловская

Редактор И.Тыкей Техред Н.Бабинец Корректор Г.Назарова

Заказ 678/6 Тираж 717 Подписное

ВН1!ИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", r Ужгород, ул.Проектная, 4

Исследование острой токсичности выделенного целевого продукта при попадании внутрь (на животных) в концентрации 10 г на 1 кг веса показали, что уреазэ не вызывает отравления. При попадании на кожу и слизистые оболочки не вызывает раздражения.

Предлагаемый способ позволяет пою лучить ферментный препарат, обладающий в 4 раза большей уреазной активностью.

Способ получения ферментного препарата, обладающего уреазной активностью, путем измельчения семян арбуза, их экстрагирования при рН 6,9

7,0 и температуре 18-25 С, очистки полученного экстракта и выделения целевого продукта, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью расширения сырьевой базы и повышения активности целевого продукта, в качестве исходного сырья используют измельченные семена арбуза сорта "Огонек" вида Сl tru1 lus Уа1цагls Schrad, экстрагирование проводят фосфатным буфером при соотношении сырье-экстрагент 1:3- 1:4 и очистку полученного экстракта осуществляют насыщенным раствором аммония сульфата, а затем этанолом при соотношении этанол-раствор 1:1,5-1:2,5.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР

11 595335 кл. В 6 1 K 35/78,28.02.78.