Способ получения оптически активных аминокислот из рацемических смесей n-ацетил- @ -аминокислот

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советскик

Социалистических

Республик

<п>910603

iмр ., бrj

Ъ б г -- Ф (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 280280 (21) 2888728/23-04 с присоединением заявки ¹â€” (23) Приоритет—

{и)М. К.

С 07 С 101/ОО

//С 07 G 7/02

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий

Опубликовано 07,03.82, Бюллетень № 9 ($3) УДК 5.47.233.. 07 (088.8) Дата опубликования описания 070382 (72) Авторы изобретения

В.М.Степанов, Л.С.Лобарева, М.К.Малинка, О.М.Амирханян, N.È.Àìèðõàíÿí, М.Ф.Еланян и P.Î.Ìàòåâîñÿí

ВсесОюэный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов и Армянский

Изобретение относится к усовершенствованному способу. получения оптически активных аминокислот путем ферментативного гидролиэа N-ацетилпроизводных рацематов аминокислот и может быть использовано в микробиологической, химической и медицинской промышленности.

Известен способ получения оптически активных аминокислот с использованием в качестве источника Фермента для гидролиэа рацематов N-ацетиламинокислот ацетонового порошка, приготовленного из коркового слоя свиных почек, илн экстрактов свиных почек (1) .

Процесс ведут при рН 7 и температуре 37оС.

Применение ферментных препаратов иэ почек для гидролиза рацематов ацетиламинокислот позволяет проводить асимметрический гидролиз многих

N-ацетил-D, L-аминокислот с хорошим выходом. Недостатками этого способа являются необходимость использования для получения Фермента дорогостоящего пищевого сырья н ограниченность использования способа связанная с тем, что препараты фермента иэ свиных почек. вообще не- гидролиэуют ацетилпронзводных таких аминокислот, как трнптофан н фенилаланин.

Целью изобретения является удешевление н упрощение процесса.

Цель достигается тем, что рацемическую смесь й-ацетил-cL-аминокислот гидролиэуют с помощью препарата амилоризина и процесс ведут в присутствии 1тонов кобальта в концентрации 1.10 — 5-10 М.

Отличительными признаками предложенного способа являются использование в качестве ферментного препарата амилорезина и проведение процесса в присутствии ионов кобальта в концентрации 1. 10 - 5-10 М. ф

Препарат амилоризин П10Х перед использованием очищают осаждением иэ водного раствора этанолом прн рН 7 н конечной концентрации этанола 50%,предйочтительно, применяя предварительное осаждение примесей иэ водного раствора фермента 20%-ныл этанолом.

П р н м е р 1. Получение L-метионнна иэ N-ацетил-D,L-метионина.

В химический стакан помещают

38,25 г (0,2 моль) й-ацетил -D,L-метнонина и 0,0196 г СоСР 6 НпО.Смесь растворяют в 400 мл воды прн 40-50 C н фильтруют на воронке Бюхнера. Затем

910603 рн прозрачного раствора доводят до

7,8 с помощью 5 н. раствора едкого натра. К реакционной смеси добавляют

0,3 r частично очищенного препарата амилоризина, растворенного в 150 мл дистиллированной воды.

Частичная очистка амилориэина

Л10Х производится следующим образом.

60 г амилориэина П10Х суспендируют в 2 л дистиллированной воды и экстрагируют при 20 и рН 7 в тече- ð ние 2 ч, затем раствор центрифугируют 1 ч при 3000 об/мин. К супернатанту при 2 С и рН 7 добавляют этанол с таким расчетом, чтобы его конечная концентрация составила 50 об.Ъ.

Выпавший в осадок белок отделяют центрифугированием, растворяют в минимальном объеме дистиллированной воды и лиофилизуют.Получают 16,5-17,0г частично очищенного ферментного препарата, активность которого,опреде- З) ленная по гидролиэу N-ацетил-D, Lметионина, составляет 85-87 ед/r.

Более эффективная очистка может быть достигнута, если экстракт амилоризина, полученный, как описано вьме, под,вергнуты предварительному осаждению этанолом при концентрации последнего 205. "Дальнейшее выделение препарата проводится так, как описано выше. Активность такого 3Q препарата 120-125 ед/г, соответственно его загрузка в опытах по гидролиэу ацетиламинокислот уменьшается.

Асимметрический гидролиз N-ацетилD,L-метионина ведут при 37-38 С в те-Я чение 30-36 ч, поддерживая рН 7,88,0 2 н. раствором едкого натра.Конец гидролиэа определяют с помощью нингидриновой реакции (по прекраще нию нарастания поглощения при 570нм) . 40

По окончании гидролиэа N-ацети-Р, L-метионина рН реакционной смеси доводят до 5 ледяной уксусной кислотой для инактивации фермента.Раствор нагревают до 80ОС, добавляют

0,5 r активированного .угля и через

10-15 мин Фильтруют на воронке Бюхнера.фильтрат упаривают в вакууме, создаваемом с помощью водоструйного насоса, при 40-50 С до 90-100 мл (при этом частично выпадают кристаллы L-метионина). К остатку добавляют 560-630 мл 96%-ного этанола и выдерживают при 4 С .4-5 ч. Выпавшие кристаллы L-метиоиина отфильтровывают на воронке Бюхнера, промывают 30млЯ этанола и высушивают при 50-60 С

5-6 ч, т.пл. 262 С (с разл.).

Выход метиоиииа 10-11 г (67-74% от теории) в расчете íà N-ацетилL-метионин. содержание основного 6О вещества не менее 98,5%.

Маточный раствор, содержащий Nацетил-D-метиоиин следовые количест ва L-метионина, уксусную кислоту, этанол, катионй Со" и йа упарива- 65 ют в вакууме и хранят для дальнейшего использования.

Пример 2. Получение L-аланина из ацетил-D, L-аланина, В химический стакан помещают 26,2 г (0,2 моль) N-ацетил-D,L-d; анилина н 19,6 мг СоС1 g 6 Н10. Смесь растворяют в 400 мл дистиллированной воды при 40-50 С и фильтруют на воронке Бюхнера, рН раствора доводят до

7„2 5н. раствором едкого натра,0,3г. очищенного ферментного препарата, полученного из амилоризина П10Х,как описано в примере 1, растворяют в

150 мл дистиллированной воды, фильтруют и добавляют к реакционной смеси.

Асимметрический гидролиз N-ацетилD,Ó-аналина проводят при 40 С в течение 30-36 ч, поддерживая рН 7,2

2 н. раствором едкого натра. Выделение L-аланина проводят аналогично тому, как описано в примере 1.

Выход L-аланнна 5,3-5,0, что составляет 60-65Ъ от теоретического в расчете на N-ацетил-L-алании.Содержание основного вещества не менее 98,5% т.пл. 297oC (c .).

Пример 3. Получение L"âàëè" на из N-ацетил-D L-валина.

В стакан помещают 15,91r(0,1 моль)

N-ацетил-Р, L-валина, 19,6 мг СоС

6 Н1О. Смесь растворяют в 400 мл дистиллированной воды при 40-50 С, горячий раствор фильтруют на воронке Бюхнера, доводят рН до 7 0 5 н, раствором едкого натра. 0,15 r очищенного Ферментного препарата, полученного из амилориэина П10Х, как указано в примере:1, растворяют в

150 мл дистиллированной воды,раствор Фильтруют и добавляют к реакционной смеси. Асимметрический гидролиз N-ацетил-D,L-валина ведут при

37-38 С в течение 30 ч при постоянном поддерживании рН раствора 7,0

2н. раствором едкого-натра.

Выделение L-валина проводят аналогично тому, как описано в примере

1. Выход L-валина 5 г (85В от теории)

Содержание основного вещества не менее 98,5%; т.пл.315ОС (с разл.).

Пример 4.Получение L-фенилаланина из N-ацетил-D,L-. Фенилаланина.

В химический стакан помещают

20,72 г (0,1 моль) И-ацетил-D,L-фенилаланина, 19 6 мл СоС1 ) 6 Н10.

Смесь растворяют в 400 мл дистиллированной воды при 40-50 С и Фильт- . руют на воронке Бюхнера. Затем рН раствора доводят до 7,0 5н. раствором едкого иатра. 0,15 r очищенного

Ферментного препарата, полученного из амилориэина П10Х„как описано в примере 1, растворяют в 150 мл воды, Фильтруют и добавляют к реакционной смеси. Асимметрический гидролиэ N-ацетил-D,L-Фенилаланина прово910603

Формула изобретения

Составитель И.Андрианова

Техред С.Мигунова Корректор Г. Решетник

Редактор З.вородкина

Заказ 1019g24 Тираж 448

ВНИИПИ Государственного комитета СССР па делам изобретений и открытий

113035,Москва, М-35, Раушская наб., д.4/5

Подписное

Филиал, ППП Патент г.ужгород, ул.Проектная, 4 дят при 37-40 С в течение 30 ч, поддерживая рН 7,0. Выделение Lфенилаланина проводят аналогично. тому, как описано в примере 1. Выход его 6,05 г (73% от теории).Содержание основного вещества не менее 98%| т.пл. 283 С (c разл.).

Пример 5. Получение Ь-фе-, нилглицина иэ N-ацетил-0,Ь-фенилглицина.

6 г N-ацетил-D,L-фенилглицииа (0,03 моль) растворяют 150 мл 0 2 н. раствора едкого натра добавляют 0,35 мл

50 Мм раствора CoSO4 . 7 Н О (конечная концентрация Co++ 10 4 И) и рН смеси доводят до 8,5-9,0 2и. раство-> ром едкого натра. К реакционной смеси добавляют 1 r препарата амилоризина П10Х. Асимметрический гидролиз N-ацетил-D,L-фенилглицината ве- дут при 50 С в течение 40-48 ч, под- 20 держивая рН 8,5. Смесь отфильтровывают, подкисляют 2 н. соляной кислоты до рН 6. Образовавшийся осадок Ьфенилглицина собирают на воронке Бюхнера и высушивают в шкафу при 60 С.

Выход L-фенилглицина 1,05 r (50% от теории).

Способ получения оптически активных аминокислот из рацемических смесей И-ацетил-й.-аминокислот путЕм их гидролиза с помощью ферментного препарата,.содержащего ацилаэу, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью удешевления и упрощения процесса, в качестве ферментного препарата для гидролиэа используют амилоризнн и процесс ведут в присутствии ионов кобальта в концентрации 1 10—

5. 10 М.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. 1.P.. Greenstein, М.Wlnitz, Chemistry oE the amino acids. т.з., с. 1831-1840, 1961 (прототип).