Способ приготовления серийных разведений для микротитрования

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Реслублик (ii>951138 (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 15. 09. 80 (21) 2987061/28-13 (51) М. Кл.з с присоединением заявки М9С 01 N 33/48

Государственный комитет

СССР но делам изобретений и открытий (23) Приоритет—

Опубликовано 150882, Бюллетень ¹ 30

Дата опубликования описания 15,08.82 (53) УДК 543. 865 (088. 8) (72) Авторы изобретения

Н.Н.Сагайдаковский и Н.Н.Сагайдаковский ) Львовский научно-исследовательский инсти эпидемиологии и микробиологии (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ СЕРИЙНЫХ РАЗВЕДЕНИЙ

ДЛЯ MHKPOTHTPOBAHHH

Изобретение относится к биологйи и медицине, в частности к микробиологии, иммунологии и вирусологии, и может быть использовано при серологических исследованиях, например для постановки реакции агглютинации или других тестов при титровании различных, биологических жидкостей в серийных разведениях. 10

Йзвестен способ приготовления серийных разведений для микротитровайия с помощью специальных

-устройств — микротитраторов. Такие устройстваа имеют: титров аль ную пластину с ячейками в виде расположенных рядами углублений, дозировочную пипетку с капельной насадкой и приспособление для разбавления титруемой жидкости. Приспособление для разбавления жидкости выполнено в виде рубашки из термостойкой пластинки, охваты-. вающей с соблюдением .зазора конец металлического стержня, и образующей по существу определенной формы открытый капиллярный сосуд заданного объема, прикрепленный к концу стержня. Другой конец стержня служит рукояткой приспособления для разбавления жидкости. Известный способ приготовленйя серийных разведений заключается в следующем. Описанный капиллярный сосуд при работе заполня-. ют титруемой жидкостью путем прикосновения стенкой этого сосуда к поверхности жидкости, имеющейся, на-, пример, в пробирке. При этом вследствие смачиваемости стенки капиллярного сосуда поверхностный слой жидкости, находящийся в пробирке, разрывается, и жидкость за счет капиллярности сосуда устремляется в его полость, заполняет ее и в дальнейшем удерживается поверхностным натяжением, в капиллярном сосуде.

Серийные разведения для микротитрования готовят, используя титровальную пластину с ячейками, дозировочную пипетку для разбавителя и приспособление для разбавления жидкости с капиллярным сосудом путем выполнения приемов с перечисленными элементами в следующей последовательности: с помощью дозировочной пипетки .разливают разбавитель в последовательный ряд ячеек титровальной пластины в объеме, равном объему титруемой жидкости, который удерживает капиллярный сосуд (например, в объеме 0,025 мп, что соответствует одной. капле). Затем капиллярный

951138 сосуд, зайолненный титруемой жидкостью опускают в первую ячейку ряда титровальной пластины, погружая капиллярный сосуд в имеющийся в ячейке разбавитель, и сообщают капиллярно- . му сосуду посредством рукоятки приспособления для разбавления жидкости несколько вращательных движений, что приводит к смешиванию в ячейке титруемой жидкости с разбавителем. При этом получают разведение в соотношении 1:2 как в той части жидкости, что находится в ячей .е вне капиллярного сосуда, так и в той части жидкости, которая заполняет полость сосуда капиллярного. Затем извлекают капиллярный сосуд из первой ячейки, при этом он захватывает своей полостью за счет капиллярности половину объема разведения из первой ячейки, и погружают капиллярный сосуд в разбавитель во второй ячейке ряда, вращают капиллярный сосуд, получая в этой ячейке разведение

1:4. Повторяя последовательно цикл перечисленных приемов, готовят серийное разведение жидкости для микротитрования в ячейках титровальных пластин. В дальнейшем для микротитрования к приготовленным описанным способом серийным разведениям добавляют необходимые компоненты, применяемые при микротитровании (например, антигены, диагностикумя и

) t1).

Недостатком способа является то, что он позволяет готовить серийные разведения в емкостях в виде ячеек титровальных пластин и не позволяет готовить серийные разведения для микротитрования на рабочей поверхнОсти любой формы, в том числе плоской без углублений, например на простых предметных стеклах, применяемых при микроскопии, что необходймо для титрования методом серийных разведений, например, в висячей капле.

Цель изобретения — приготовление серийных разведений для микротитрования на рабочей поверхности любой формы, в том числе плоской без углублений.

Поставленная цель достигается предлагаемым способом приготовления серийных разведений для микротитрования смешиванием в требуемых соотношениях титруемой жидкости, содержащейся в открытом капиллярном сосуде, и разбавителя, подаваемого с помощью дозатора, причем отличительными особенностями способа является то, что смешивание титруемой жидкости с разбавителем осуществляют непосредственно на капиллярном сосуде путем внесения заданной дори разбавителя в полость капилляра, пе» реполнля его, часть полученного разведения, переполняющую капилляр, наносят на рабочую поверхность титрования, и процесс повторяют необходимое число раз.

Для приготовления разведений(5 при соотношениях титруемой жидкости и разбавителя 1:2, 1:4, 1:8, 1:2 " (где и — целое число, не равное нулю),,используют равные дозы титруемой жидкости и раэбавителя.

Более детально операции, составляющие описываемый способ, могут быть охарактеризованы следующим образом.

Смешивают титруемую жидкость в требуемых соотношениях с разбавителем при помощи дозатора, например дозировочной пипетки для подачи разбавителя, и приспособления для разбавления жидкости с капиллярным сосудом. Дозировочная пипетка для подачи разбавителя имеет заполненный разбавителем выходной канал, оканчивающийся выходным отверстием, через которое подают пипеткой разбавитель в заданном объеме (дозе).

Приспособление для разбавления жидкости представляет собой стержень, с прикрепленйым к концу этого стержня открытым капиллярным сосудом заданного объема, т.е. сосудом, обладающим .способностью заполняться жидкостью за счет капиллярности и удерживать заполнившую его жидкость за счет капиллярности сосуда и поверхностного натяжения жидкости. Запол35 нившая капиллярный сосуд жидкость в дальнейшем удерживается в нем за счет капиллярности и поверхностного натяжения и после отдаления капиллярного сосуда от поверхности жидкости, имеющейся, например, в пробирке. Емкость капиллярного сосуда представляет собой микрообъем (малым объемом до 0,025 мл). Капиллярный сосуд имеет форму аналогичную известному капиллярному сосуду приспособления для разбавления жидкости или представлен, например, просто открытой полусферой со щелями, прикрепленной к стержню. Используемые варианты капиллярного сосуда представляют собой открытый капиллярный сосуд заданного объема, оба приведенных варианта капиллярного сосуда дают одинаковый эффект, не оказывая влияния на сущность предлагаемого способа. Для приготовления серийных разведений титруемой жидкосTH на заполненный титруемой жидкостью капиллярный сосуд наносят разбавитель в объеме, поданном дозиробО вочной пипеткой. При этом разбавитель в поданном объеме, слившись с титруемой жидкостью, удерживаемой капиллярным сосудом, образует смесь этих компонентов, представляющую со6$ бой разведение титруемой жидкости

951138 с разбавителем, которое удерживаетсяна переполненном капиллярном сосуде.

Одна часть этого разведения заполняет капиллярный сосуд, а другая часть, удерживаемая поверхностным натяжением жидкости, обволакивает капиллярный сосуд снаружи и переполняет его. При слиянии поданной дозы разбавителя с титруемой жидкостью, удерживаемой в капиллярном сосуде и заполняющей его, происходит взаимное смешивание компонентов. Получив разведение титруемой жидкости путем такого переполнения разбавлением капиллярного сосуда, избыток приго товленного разведения, т.е. переполняющую капиллярный сосуд часть разведения, равный объему поданной дозы разбавителя, наносят на рабочую поверхность для титрования любой формы, в том числе плоскую без углублений, например на поверхность простого предметного стекла, освобождая при этом капиллярный сосуд от переполняющей его расти разведения, обволакивающей капиллярный сосуд снаружи. Затем на освободившийся от избытка разведения капиллярный сосуд, заполнен ный той частью разведения, которая осталась в нем после освобождения капиллярного сосуда от переполняющей .части разведения (оставшаяся В капиллярном сосуде часть разведения равна объему капиллярного сосуда, его емкости, и удерживается в нем за счет капиллярности сосуда и поверхностного натяжения жидкости), подают с помощью дозировочной пипетки очередную дозу разбавителя, равную объему разбавителя, поданного при первой (предыдущей) подаче, и нанеся эту дозу разбавителя на капиллярный сосуд, опять его переполняют. Приготовив очередное разведение также путем указанного переполнения капиллярного сосуда, часть этого разведения, переполняющую капиллярный сосуд, наносят на сле ующий свободный участок рабочей поверхности для титрования, освобождая капиллярный сосуд от переполняющей его части разведения. Затем подают . на капиллярный сосуд следующую дозу разбавителя, и, повторяя цикл пере™ численных приемов в указанной последовательности, готовят серийные разведения жидкости для микротитрования на рабочей поверхности любой форМи.

На фиг.1 схематически представлена операция заполнения сывороткой капиллярного сосуда; на фиг.2 — операция подачи физраствора на заполненный сывороткой капиллярный сосуд; на фиг.З вЂ” начальный момент операции нанесения разведения сыворотки на рабочую поверхность для титрования; на фиг.4 — завершающий момент операции нанесения разведения на рабочую поверхность. для заполнения капиллярного сосуда 1 приспособления для разбавления жидкости 2, опускают это приспособление, например, в пробирку 3 и прикасаются стенкой капиллярного сосуда к поверхности 4 сыворотки 5, не погружая капиллярного сосуда в жидкость (прикасаются стенкой капиллярного сосуда к мениску). При этом вследствие смачиваемости капиллярного сосуда поверхностный слой. сыворотки разрывается, и сыворотка из пробирки устремляется в капиллярный сосуд .и его заполняет. После заполнения сывороткой этЬт сосуд отводят от поверхности сыворотки. Заполнившая капиллярный сосуд сыворотка в ,дальнейшем удерживается в этом сосуде за счет капиллярности и поверхностного натяжения жидкости.

На заполненный сывороткой сосуд

20 затем подают физраствор.

Для подачи физраствора на заполненный сывороткой капиллярный сосуд (фиг.2) направляют выходное отверстие б выходной канал 7 дозироэ5 вочной пипетки 8, заполненной физраствором, на капиллярный сосуд 1 приспособления для разбавления жидкости 2, так как устанавливают дозировочную пипетку по отношению к приспособлению для разбавления жидкости в таком положении, чтобы выходной канал пипетки оказывался направленным (нацеленным) своим выходным отверстием на заполненный сывороткой капиллярный сосуд, размещенный напротив выходного отверстия пипетки. При этом расстояние 9 между концом выходного канала пипетки (концом пипетки) и капиллярным сосудом подбирается достаточным для того, 40 чтобы при имеющейся скорости вытекания физраствора из отверстия пипетки физраствор попадал. на капиллярный сосуд и во всей поданной дозе (т.е. в заданном объеме) оказался нанесенным на капиллярный сосуд, переполняя этот сосуд. При слиянии поданного укаэанным образом физраствора с сывороткой, заполняющей капиллярный сосуд, происходит взаимное смешивание .этих компонентов, и полученная в результате этого смесь представляет собой первое разведение сыворотки физраствором в серийном разведении. Одна часть данного разведения заполняет.капиллярный сосуд, а другая часть, равная объему поданной дозы физраствора, переполняет капиллярный сосуд. Эта, переполняющая капиллярный сосуд часть разведения 10 обволакивает капиллярЕО ный сосуд и удерживается снаружи этого сосуда за счет поверхностного натяжения жидкости, не прикасаясь к концу пипетки. После получения на капиллярном сосуде разведения тит$5 руемой сыворотки, переполняющую

981138 капиллярный сосуд часть разведения

10 (т.е. ту часть разведения, которая переполняет капиллярный сосуд и равна по объему поданной на капиллярный сосуд, дозе разбавителя — физраствора) наносят на рабочую поверхность для титрования, т.е. на поверхность стеклянной пластины.

Для нанесения разведения сыворотки на рабочую поверхность 11 (фиг. 3) приближают переполненный разведением капилляр ный сосуд 1 приспособления для разбавления жидкости 2 к рабочей поверхности для титрования, обеспечивая достаточный контакт (прикосновение, переполняющей капиллярный со- . суд части разведения 10 с рабочей по- 5 верхностью. При этом капиллярный сосуд приближают до такого предела, когда сцепление между жидкостью (переполняющей сосуд) и рабочей поверхностью отказывается достаточным для. 20 того, чтобы переполняющая капиллярный сосуд часть разведения оторвалась от остальной части разведения, заполняющей капиллярный сосуд, при выполнении следующей (очередной) 25 операции, а именно при отдалении капиллярного сосуда от рабочей поверхности для титрования.

При удалении капиллярного сосуда

1 приспособления для разбавления жидкости 2 от рабочей поверхности 11 (фиг.4) этот сосуд освобождается от переполняющей его части разведения

10, которая оторвавшись от разведения, заполняющего капиллярный ,сосуд, располагается в виде капли на рабочей поверхности для титрования. На этом завершается цикл операций приготовления первого разведения сыворотки.

Для приготовления второго разве- 40 дения на капиллярный сосуд, освободившийся от переполняющей его части первого разведения сыворотки, но эа. полненный оставшейся в нем частью разведения (удерживающейся в капил- 45 лярном сосуде за счет капиллярности и поверхностного натяжения, и равную объему этого сосуда), подают указанным образом очередную порцию физраствора в объеме, равном объему физраствора, поданного при первой подаче, опять переполняя капиллярный сосуд физраствором в поданной дозе.

При слиянии этой второй фазы физраствора с разведением сыворотки, имеющимся в капиллярном сосуде, получают второе разведение сыворотки. Часть этого разведения в объеме, переполняющем капиллярный сосуд, наносят описанным образом на следующий свобо дный участок рабочей поверхности для Щ титрования путем приближения капиллярного сосуда к рабочей поверхносаи для титрования до требуемого предела.

Затем капиллярный сосуд удаляют от рабочей поверхности, освобождая этим Я его OT избытка разведения, которое в виде капли располагается на рабочей поверхности. На освободившийся от переполняющей его части второго разведения капиллярный сосуд подают дозировочной пипеткой в укаэанном объеме (дозе) очередную порцию физраствора, и, повторяя цикл перечисленных приемов, готовят серийные разведения сыворотки для микротитрования на плоской рабочей поверхности стеклянных пластин °

Предлагаемый способ приготовления серийных разведений для микротитрования быз использован для постановки реакцйи агглютинации, которая включила приготовление серийных разведений иммунных сывороток лабораторных животных (морских свинок) для микротитрования на плоской рабочей поверхности, представленной поверхностью стеклянной пластины.

Пример. Для приготовления серийных разведений с помощью предлагаемого способа смешивают титруемую жидкость, в данном конкретном случае смешивают сыворотку крови иммунных животных (в дальшейшем в тексте употребляется термин "сыворотка") в требуемых соотношениях с разбавителем, которым служил физиологический раствор (0,85%-ный раствор хлорида натрия — далее в тексте

"физраствор") при помощи дозировочной пипетки для подачи физраствора и приспособления для разбавления жидкости с капиллярным сосудом. При подаче пипеткой физраствор вытекал через ее выходное отверстие. Эта пипетка может быть также охарактеризована более широко как простейший дозатор разбавителя, имеющий выходное отверстие для подачи через данное отверстие разбавителя в заданной дозе. Приспособление для разбавления жидкости было представлено стержнем с прикрепленным к его концу капиллярным сосудом, т.е. открытым сосудом, обладающим свойством заполняться жидкостью за счет капиллярности при соприкосновении стенки этого со суда с поверхностью жидкости, имею.щейся, например, в пробирке.

С целью приготовления серийных разведений для микротитрования при соотношениях сыворотки и физраствора, выраженных прогрессией 1:2, 1:4, 1:8, и т.д. физраствор подают на заполненный капиллярный сосуд при каждой подаче в объеме, равном объему этого сосуда, т.е. объему.сыворотки, которая удерживается в капиллярном сосуде при его заполнении за счет капиллярности и поверхностного натяжения. При первой подаче физраствора получают первое разведение сыворотки в пропорции 1:2, при второй подаче физраствора первое разведение разбавляют вдвое, получая раз951138

20

Сыв о- ротки,Р

Формула изобретения

1:32

1:3?

1:64

1:64

1:32

1:64

1:32

1:128

1:32

1:32

1: 128

1: 128

1:64

1:128

1:64

1:64

1:32

1:32

1:32

1:32

1:64

1:64

1:32

1:64

1:64

1:64

1:32

1:64

1:128

1:128

d0

1:32 16

1:32 ведение сыворотки в пропорции 1:4.

При последующей подаче физраствора получают разведения. 1:8, 1:6 и т.д.

К приготовленным указанным образом серийным разведениям сыворотки добавляют при постановке реакции агглютинации антиген из риккетсий

Провачека (испольэовался коммерческий препарат Львовского предприятия по производству бакпрепаратов).

В параллельной серии опытов ставят реакцию агглютинации с этими же сыворотками и антигеном при приготовлении серийных разведений с помощью известного способа. Результаты реакции учитывают по высоте разведений сыворотки, т.е. по высоте титров, дающих агглютинацию.Всего в параллельных опытах было исследова— но 16 сывороток.

В таблице приведены результаты исследования сывороток в реакции агглютинации.

Высота титров реакции агглютинации при приготовлении серийных разведений

Представленные в таблице данные показывают, что результаты исследования сывороток в реакции агглютинации при приготовлении серийных разведений с помощью предлагаемого спосбба и микротитратора системы Такачи практически однозначны. Отмеченные кОлебания в пределах одного разведения представляют собой обычное явление-, неизменно наблюдаемое при сопоставительном анализе результатов разного рода серологических реакций, в том числе и реакции агглюти нации.

Технико-экономическая эффективность изобретения заключается в том, 15 что предлагаемый способ позволяет готовить серийные разведения для микротитрования на плоской поверхности. Предлагаемый способ может быть также использован для приготовления серийных разведений на рабочей поверхности для титрования и любой .другой формы, например, на поверхности, имеющей .углубления разного профиля и т.п.

1. Способ приготовления серийных разведений для микротитрования смешиванием в требуемых соотношениях титруемой жидкости, содержащейся в открытом капиллярном сосуде, и разбавителя, подаваемого с помощью дозатора, отличающийся тем, что, с целью приготовления серийных разведений на рабочей поверхности любой формы, в том числе плоской, без углублений, смешивание осуществляют непосредственно на капиллярном сосуде путем внесения эаданной дозы разбавителя в полость капилляра, переполняя его, часть полученного разведения, переполняющую капилляр, наносят на рабочую поверх45 ность титрования и процесс повторяют. необходимое число раз.

2. Способ по п.1, о т л и ч а— ю щ и и сятем,,что, с целью при.готовления разведений при соотношениях титруемой жидкости и разбавителя 1:2, 1:4, 1:8, 1:2" (n — целое число, не равное нулю), используют равные дозы титруемой жидкости и разбавителя.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Инструкция к аппарату "Микротитратор системы Такачи". Фирма

".Лабор". Будапешт, 1972.

951138

Составитель О. Скородумова

Редактор Т.Парфенова Техред М.Рейвес Корректор И.Муска

Подписное

Заказ 5934/47 . Тираж 887

RHIIHIIH Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва,Ж-35, Раушская наб., д.4/5 филиап ППП "Патент", r.ужгород, ул.Проектная,4