Способ получения претромбина 1

 

Союз Советски к

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (SI ) Дополнительное к авт. санд-ву (22) Заявлено 27.03.81 (21) 3307071/28-13 с присоеаинением заявки № (23) Приоритет (51) М. Кл .

А 61 К 35/16

5Ьеуюаратвекый кенитет

ГССР ао двлаи каааретаиив и открытка

Опубликовано 15 11.82. Бюллетень № 42

Дата опубликования описания 17.11.82 (53) УДК 612,115. .12(088.8) Г

С.M. Струкова, Т. Н, Митрошина и Б.А. Кудрявцев::. .. -, „ -"., g

", 1((j

:,. 1

Московский ордена Ленина, ордена Октябрьской Революции и ордена Трудового Красного Знамени государственнь1й. университет им. М.В. Ломоносова (72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕТРОМБИНА та 11 1.

Изобретение относится к медицине и мотает быть применено для диагностики состояния противосвертывающей системы, а также для активации ее функции с целью профилактики заболеваний сердечно-сосудистой и других систем, осложненных тромботйческими явлениями.

Известен способ получения претромбина 1 путем осаждения IlpoTpoMGMHQBo

ro комплекса из плазмы крови, гидролиза его тромбином с последующей хроматографической очисткой гидролиза"

Однако известный способ обеспечивает низкий выход целевого продукта (20-253 ) и, кроме того, способ дли" телен и трудоемок (требует 29-33. ч) и не позволяет получить высокоочищенный продукт.

Цель изобретения - увеличение выхода и чистоты целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения претромбина 1 путем осаждения протромбинового комплекса из плазмы крови, гидролиза его тромбином, с последующей хроматографической очисткой гидропиэата, гидролиэ протроибинового комплекса осуществляют в среде, содержащей этилендиаминтетраацетат натрия и трис-буфер, хроматографическую очистку гидролизата осуществляют на сорбенте гепарин-сефароза и элюируют целевой продукт в линейном градиенте хлорида натрия с концентрацией 0,05-1,5 М в трис-ацетатном буфере при рН 6,06,2 и концентрации хлорида кальция

2,4-2,6 ммоль.

П р и и е р 1. Протромбиновый комплекс получают осаждением его иэ плазмы быка на цитрате бария, поспедуго ющей элюцией, фракционированием сульфатом аммония и изоэлектрическим осаждением.

3 . 9731

Берут 20 мг протромбинового комплекса (2000 11Н ед. на 1 мг белка) и инкубируют с 300 1Н ед. тромбина (2000 и EH ед. на 1 лг белка) в 0 05 М трис-НГ1 буфере, рН 7,4, содержащем

1 ммоль ЭДТА-натриевой соли 15 мин при 37 С (соотношение фермента и: субстрата по единицам активности

1:1300) . Р акционную смесь диализуют против 0,02 И трис-ацетатного буфера, 10 рН .6,0, содержацего 0,05 М NaCE E5 ч.

4атен в диализат добавляют 0,4 И раствор ГаС1 до конечной концентрации

2,5 ммоль и наносят в объеме 6 мл на колонку с гепарин-.сефарозой.(1х40 см) t5 уравновешенную 0,02 ммоль трис-ацетат. ным буфером, рН 6,0, содержащим

0,05 И МаС1 и 2,5 ммоль СаС1 . Пер вую элюцию проводят тем же буфером объеме 60 мл. Затем проводят гра- 20 диентную элюцию, используя для создания линейного градиента ионной силы следующие растворы: EÎÎ мл 0,02 И трис-ацетатного бу*ера, рН 6,0, содержащего 0,05 И 51аС1 и 2,5 мИ СаС1, 25 и 100 мл того же буфера, содержацего

1,5 И ЯаС1. В .элюируемых фракциях анализируют .содержание белка и свертывающую активность. Со свободным объемом колонки выходят несвязавшие- зв ся белки (20 ), среди которых обнаруживают фрагмент 1 протромбина с молекулярной,массой 25000, отщепляемый от молекулы протромбина тромбином в процессе гидролиза. Градиентной элюцией получают три белковых компонента. Первый компонент, содержащий 703 нанесенного белка, элюируется 0,45 M

11аС1. Молекулярная масса компонента определена равной 60000. Компонент идентифицирован как претромбйн 1.

При концентрации КаС1 0,64 И элюируют второй компонент, содержащий 53 нанесенного белка с молекулярной массой 50000, не проявляющий характерных свойств претромбина 1 и тромбина и идентифицированный как фактор X. При увеличении концентрации ЦаС1 до 0,9 И элюируется третий компонент,, содержаий следовые количества тромбина

О,E h3EH ед. íà E мл элюата/.

Нз 20 мг тромбинового гидролизата протромбина получают 14 мг претромбима 1, гомогенного при электрофорезе в геле полиакриламида, с молекуляр- ной массой 60000, не обладающего фибриноген-свертывающей, эстеразной, фибринолитической и протромбиновой ак29 4 тивностями. Претромбин 1 медленно (в течение часа) генерирует тромбин (80+2 ед/мг в присутствии фактора

X /2 ед/мг). Полученные препарыты претромбина 1 проявляют высокую физиологическую активность, возбуждая функцию противосвертывающей системы при внутривенном введении крысам в концентрации 0,5 мг/кг веса тела.

В табл. 1 показано изменение биохимических показателей состояния противосвертывающей системы после внутривенного введения претромбина 1 (0,5 мгlкг веса) . . Таким образом, претромбин 1, введенный внутривенно крысам в концентрации 0,5 мг/кг веса, уже на 1-ой мин опыта вызывает статистически достоверное увеличение суммарной Фибринолитической активности (СФА) на 363 и неферментативного фибринолиза (НФ), отражающего уровень комплексных соединений гепарина с белками крови и биогенными аминами, на 413. Выброс ,гепарина в кровоток является важнейшим этапом эффекторной реакции противосвертывающей системы.

Таким образом претромбин 1, при внутривенном введении Крысам в низкой дозе 0,5 мгlкг веса активирует функцию противосвертывающей системы, что говорит о хорошем качестве препарата.

fl р и м е р 2. Протромбиновый комплекс получают как в примере 1. Затем берут 30 мг протромбинового комплекса (2000 М1Н ед.,на 1 мг белка) и инкубируют с 30 Й1Н ед. (2000 N1H ед. на 1 мг белка) тромбина в 0,05 И трисНС1 Fiy6epe, рН 7,4, содержащем

1 миоль ЭДТА-натрйевой соли, 20 мин при 370 C. Соотношение фермента и субстрата по единицам активности 1:2000..

Последующие операции проводят как в примере 1. Получают 21 мг претромбина 1, гомогенного при электрофорезе в гене полиакриламида, с молекулярной массой 63000, не обладающего йибриноген-свертывающей, эстеразной (по ТАМЭ и БАИЭ), фибринолитической и протромбиновой активностью. Претромбин 1 генерирует тромбин (90+10 ед./мг) в течение часа в присутствии фактора

Хо (2 ед./мг). Препарат претромбина 1 проявляет высокую физиологическую активность при анализе методом перфузии гуморально изолированного, но с сохраненными нервными связями с ор ганизмом каротидного синуса кролика. В табл. 2 показано изменение биохимичес1"-9 6 ствуя с хеморецепторами только одной из рецепторных зон противосвертывающей системы, в очень малых концентрациях (0,07 мг/мл) вызывает рефлекторный ответ этой системы, соэдаюций вы сокий антикоагулянтный и фибринолитический фон и предотвращающий угрозу тромбообраэования при провокации тромбиногенеза.

973

Предлагаемый спосоо позволяет по- . лучить целевой продукт эа 10-12 ч против 29-33 ч известным способом. Выход претромбина составляет 65-753 по сравнению .с известным 20-253. Претромбин 1, полученный предлагаемым способом, свободен от примеси диизопропилфторфосфат-тромбинв, который обладает физиологической активно стью.

Таблица

Суммарная фибринолитическая активность, мм

Условия oflUTi

Стати стические показатели

Время после введения, мин

1 5

1----45,42 6

48,8-2, О

58,8+2,1

56,8+2,7

Контроль

0,85".: МаС!

Опыт

64,2+3,1

72,6 4,2

83,0+7 8

77,". 3 9

И+и

Претромбин 1

И р

<0,001 с0,01 с 0.,02 с0,001

Таблица 2

Неферментативный фибринолиэ, Ф

Время рекальцификации плазмы, л

Время после перфузии, мин

Ъ

136,2+10,7 (6) с0,01

134,6+11,2 (6) ф

182,0Ф1 3,2 (6)

< 0,001

161,8Ы 9,0 (6) с 0,01

131,2 5,8 (6) с 0,001

132,0+ 9,0 (6) с 0,01

П л и/и /

Ил и/и/

10 с0,02 ких показателей состояния противосвертывающей системы после перфуэии каротидного син са кролика претромбино л 1 (0,07 мгlмл в объеме 20 мл).

Таки л образом, при перфуэии пре" тромбином.1, полученным в примере 2 . изолированного каротидного синуса кролика происходит активация противосвертываоцей системы, характеризующаяся статистически достоверным уве- 10 личением к 5-ой мин опыта времени рекальцификации плазмы на 314, суммарной фибринолитической активности на,363, неферментативного фибринолиза - на 82 ;. Высокий антикоагулянтный1з фон, создаваемый комплексными соединениями гепарина, сохраняется на

10-ой мин опыта.

Изложенные данные свидетельствуют о том, что претромбин 1, взаимодей" зв

Статисти- Суммарная фибриноческие литическая актрвпоказате- ность, ли

Неферментативный фибринолиз, мм 2.

Время после введения, мин

973129

Продолжение табл. 2

30 Ийм/и! ° 109,6+4,4 (6) 138,2+23,4 (6) 104 >5+18,3 (6) P <0,1 <0,2 )i0,5

90 НЬл/и I 118,429,2 (6) 123,2+13,4 6 112, 3+6,6 (6) P (0,! <0,2 <0,2

П р и м е ч а н и е. За 1003 принят исходный Фон при перфузии раствором Рингера-Локка.

Формула изобретения

Составитель С. Иалютина

Редактор Т. Митрович Техред Т.йаточка Корректор В. Прохненко

Заказ ВЯ5/5 Тираж 714 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035 Москва 3-35 Раушская наб. g 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Способ получения претромбина 1 путем осаждения протромбинового комплексе иэ йлаэмы крови, гидролиэа его

20 тромбином с последующей хроматографической очисткой гидролизата, о тл и ч а ю"щ- Й и с я тем, что, с це лью увеличения выхода и чистоты целевого продукта, гидролиз протромби- ., нового комплекса осуществляют в среде, содержащей этилендиаминтетраацетат натрия и трис-боер, хроматографическую очистку гидролизата осуществляют на сорбенте гепарин-сефароза и элюируют целевой продукт в линейном градиенте хлорида натрия с кон Центрацией 0,05-1,5 М в трис-ацетатном буфере при рН 6,0-6,2 и концентрации хлорида кальция 2,4-2,6 ммоль.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

I. Heldebrant С.И., Butkowski R.1., Ва1а) S.Р., Harm К.G. The activation

of prothrombin. - "I. 01о1. Chem.,"

1973 v. 248, р 7149 7l63.