Способ получения изолированных клеток печени

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 010880 (21) 2969614/28-13 (53) М. КП.

С 12 М 9/00 с присоединением заявки ¹â€” (23) Приоритет

Государственный комитет

СССР ио делам изобретений и открытий

Опубликовано 230882. Бюллетень ¹ 31 (53) УДК 576.8. .093.3(088.8) Дата опубликования описания 230882 (72) Авторы изобретения

В.П.Гринчишин, Л.А.Осипова и М.П.Винар

Институт проблем онкологии им.Р.Е.К

АН Украинской ССР

Ю (7t) Заявитель (54) СПОСОБ ПО71УЧЕНИЯ ИЗОЛИРОВАННЫХ

ХЛЕВОК ПЕЧЕНИ

Изобретение относится к экспериментальной медицине.

Известен способ получения изолированных клеток печени путем промывания печени через кровеносную сис5 тему органа промывным раствором с последующим извлечением печени, перфузированием ее солевым раствором с добавлением коллагеназы, дезагрегацией, инкубированием и отделением полученных клеток (11 .

Однако при известной способе выход жизнеспособных клеток невысок и составляет 75-90%.

Целью изобретения является по- 15 вышение выхода жизнеспособных клеток.

Цель достигается тем, что согласно способу получения изолированных клеток печени путем промывания печени через кровеносную систему органа промывным раствором с последующим изв" лечением печени, перфузированием ее ,солевым раствором с добавлением кол-. лагеназы дезагрегацией,инкубировани25 ем и отделением полученных клеток,отличительной особенностью является то, что промывание печени проводят оксигениров ан ным р аст вором, содержащим вес.В:

Хлористый натрий 0,83-0,85

Лимоннокислый натрий 0,95-0,97

Гепарин (О у 5-1,0) ° 10

Глюкозу 0,05-0,15

Дистиллированную воду Остальное в течение 20-30 мин при температуре раствора 16-18оС, перфузируют оксигенированным раствором, содержащим, вес. В:

Хлористый натрий 0,79-0,82

Хлористый калий 0,035-0,045

Фосфорнокислый калий однозамещенный 0,005-0,007

Фосфорнокислый натрий двузамещенпый 0,014-0,016

Хлористый кальций 0,04-0,09

Коллагеназу 0,025-0,05

Глюкозу 0 05-0 15

Дистиллированную воду Остальное инкубирование осуществляют в течение

20-30 мин при 37оC.

Пример. Вскрывают бркханую и грудную полости декапитированной крысы. Перевязывают нижнюю полую вену выше места ответвления правой почечной вены и перерезают дистальнее лигатуры. Надсекают нижнюю полую вену в месте впадения ее в предсердие. В

952958

Коллагеназа 0,035

Глюкоз а 0,1

Дистиллированная вода Остальное

Перфузионный раствор также насы5 щают кислородом и поддерживают рН в пределах 7,35-7,60 с помощью 10Ъ вЂ ного бикарбоната натрия. Перфузию проводят со скоростью 6 мл/мин при

37 С в течение 20 мин.

После прекращения перфузии дают 0 стечь избытку раствора из органа, взвешивают 5-6 г ткани, надрезают в .нескольких местах капсулу, помещают в стакан с 40 мл раствора, использовавшегося при перфузии, и ин15 кубируют в термостате при 37 С и постоянном помешивании. Через 15 мин клетки, перешедшие в суспензию, фильтруют через слой батиста, к остатку ткани добавляют оставшиеся 35 мп перфузионного раствора, вторично инкубируют 10 мин, и вновь фильтруют. В объединенном фильтрате — первичной клеточной суспензии — определяют количество клеток и процентное содержание неповрежденных гепатоцитов, например цитологическими методами с трипановым синим.

В таблице представлены данные по выходу жизнеспособных гепатоцитов при суспенжировании печени крысы пред лагаемым способом.

Количество клеток, млн.

Вес крысы, г

Из 1 г печени Из органа

37,3 + 1,55 270,9 + 15,3

91 + 0,6

115-155

50,0 + 1,02 434,0 .19,7

95 + 1,1

185-200

Выход клеток при использовании предлагаемого способа составляет

225,5 млн. в пересчете на 100 г массы тела крысы, из которых живых

214,2 млн (95Ъ), тогда как известным способом можно получить только

111,4 млн. (82,5Ъ) живых при общем количестве 135 млн. клеток, т.е. в 1,9 раза меньше. При этом воспроизводимость предлагаемого способа зна-. чительно вьпае по сравнению с известным, т.е. выход клеток при применении предлагаемого способа варьирует в пределах + 1,1Ъ, а известном—

Ф7,5Ъ. 60

Формула изобретения

Способ получения изолированных клеток печени путем промывания пе- 65 просвет сосуда вводят притупленную инъекционную иглу соответствующего диаметра и с помощью перистальтического насоса проводят промывку печени раствором, содержащим, вес.Ъ:

Хлористый натрий 0,84

Лимоннокислый натрий 0,96

Гепарин 0,7 10

Глюкоза 0,1

Дистиллированная вода Остальное перерезают сосуды портальной триады, после чего фиксируют лигатурой иглу и освобождают печень от связок. Промывку осуществляют со скоростью

6 мл/мин при температуре 16-18 C.

Количество раствора берут примерно равным массе животного. Раствор за

20-30 мин, до промывки и в процессе промывки насыщают кислородом.

По окончании этой операции печень переносят на воронку с ситечком из нержавеющей стали и рециркуляторно перфузируют 75 мл раствора, содержащего вес.Ъ:

Хлористый натрий 0,8

Хлористый калиЙ 0,04

Фосфорнокислый калий 0,006

Фосфорнокислый натрий 0,016

Хлористый кальций 0,07

Количество неповрежденных гепатоцитов (в Ъ от общего количества клеток) чени через кровеносную систему органа промывным раствором с последующим извлечением печени перфуэированием ее солевым раствором с добавлением коллагеназы, дезагрегацией, инкубированием и отделением полученных клеток, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения выхода железоспособных клеток, промывание печени проводят оксигенированным раствором, содержащим, вес.Ъ:

Хлористый натрий 0,83-0,85

Лимоннокислый натрий

Гепарин

Глюкозу

Дистиллированную воду Остальное в течение 20-30 мин при температуре раствора 16-18 С, перфузируют оксиге952958 содержащим

0,79-0,82

0,035-0,045

0,005-0,007

0,014-0,016.

0,04-0,09

0,025-0.,05

Редактор Г. Волков а

Заказ 6215/43 Тираж 505 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная,4 нированным раствором, вес.Ъ:

Хлористый натрий

Хлористый калий

Фосфорнокислый калий однозамещенный

Фосфорнокислый натрий двузамещенный

Хлористый кальций

Коллагеназу

Глюкозу 0,05-0,15

Дистиллированную воду Остальное инкубирование осуществляют в течение 20-30 мин при 37 С.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. In vitro, Robert f . Bonney

nAdultiver parenchymal cells in primary culture i characteristics and

ce1I recognition" 1974, 10, М 1-2, р.р.130-142.

Составитель С. Малютина

Техред М.Тепер Корректор В.Бутяга