Способ количественного определения фибриногена в плазме крови

 

(»(978862

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свнд-ву (22) Заявлено 03.03.80 (21) 2890159/28-13 с присоединением заявки № (23) П рнорнтет

Опубликовано 07.12.82. Бюллетень № 45

Дата опублнковання описания 07.12.82 (51)M. Кл.

А 61 К 35/16

РтеуАарстваниый комитет

СССР

Ао делам изобретений и открытий (53) УЙК621.398. . 132 (088.8) f (72) Авторы изобретения

Ю.. БуКфйтс-., „ .

1 (у

1"-=Ф,, ii

ii биохимии ((В. А. Белицер, Т. В. Варецкая, Л. А. Барюк, и О. А. Буняк

Ордена Трудового Красного Знамени институт им. А. В. Палладина (71) Заявитель (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

ФИБРИНОГЕНА В ПЛАЗМЕ КРОВИ

Изобретение относится к области ме- дицины и может быть использовано при диагностике и лечении многих заболеваний, связанных со снижением или повышением содержания фибриногена в крови.

Известен способ количественного определения фибриногена в плазме крови путем добавления фосфатного буфера, инкубирования смеси с тромбином, извлечения сгустка фибрина, промывки, раство

t0 рения в шелочи и определения количества белка )1 ) .

Однако известный способ длителен, а сильно варьирующая мутность щелочных растврров белка снижает достоверность результатов. целью и(Зобретения является повышение точности и ускрение определения фибриногена.

Бель достигается тем, что при ооу20 ществлении способа количественного определения фибриногена в плазме крови ттурем добавления фосфатноГЬ буфера, инкуби рования смеси с тромбином извлечения сгус-!

Ф тка фибрина, промывки, растворения и определения количества белка добавляют в смесь плазмы с фосфатным буфером раствор моноиодоуксусной кислоты, инкубируют смесь с тромбином, содержашим ионы кальция, а отмытый сгусток растВеряют в 1,5%-ной уксусной кислоте, взятой в количест;ве (20-25), 1 по отношению к исследуемой плазме.

Пр и м е р . В пробирку (диаметром

9-10 мм, высотой 85-90 мм) вносят

0,2 мл плазмы, полученной из крови при использовании в качестве антикоагулянта оксалата калия или цитрата натрия, прибавляют 1,6 мл 0,06-молярного фосфат- ного буфера (рН 7,0). Смесь помешают

h водяной термостат, установленный на

37 С. Через несколько минут вносят в

0,1 мл 0,04-молярного раствора моноиодоуксусной кислоты, спустя 3 мин прибавляют 0,1 мл (10 единиц) раствора тромбина, приготовленного, как описана

Тираж 714

Подписное

Филиал ППП "Патент, г. Ужгород, ул. Проекдная, 4

3 97 выше. После прибавления каждого компонента содержимое пробирки тшательно перемешивают стекляной палочкой с шероховатой поверхностью. Палочку оставляют в пробирке. Смесь выдерживают при 37 С 15 мин (более продолжительное выдерживание допускается). После этого пробирку, вынимают из термо- стата, образовавшийся сгусток извле0 1 кают наматыванием на палочку, жидкость сливают и максимально удаляют из сгустка, прижимая его палочкой к стенкам пробирки. Сгусток на палочке промывают три раза в 0,15-молярном растворе хлористого натрия, погружая по несколько раз в каждый из трех стаканчиков, содержаших по 50-100 мл раствора хлористого натрия. Остатки промывной жидкости удаляют из сгустка фильтровальной бумагой. Промытый сгусток расгворяют в 1,5 -ной уксусной кислоте, помешая . его в пробирку (диаметром 13-15 мм), содержашую 5 мл уксусной кислоты, и размешивая. Растворение происходит очень быстро, заканчивается до 5 мин.

В полученном растворе определяют содержание белка спектрофотометрически, измеряя экстракцию при длине волны 280 и 320 нм.

В данном примере E =-0,193; E

=0,013.

280 320

Содержание фибриногена. рассчи1 ывают по фоРмУле, X= " - ==мг фибриногена. где E - разница величин экс(ьВо-Э о) тракции, полученных при длинах волны 280 и 320 нм;

25000 - коэффициент для выражения в мг количества фибриногена, полученного при анализе 0,2 мл плазмы;

14,84 - коэффициент экстинкции (E " ) для фибриногена в кислой среде при длине волны

280 нм.

В приведенном» примере (6,1 9Ъ-О,ОО) 2.ОООО o/

14,g4.

Умножив полученную величину на ра бавление плазмы антикаагулянтом, полуВНИИПИ Заказ 9442/7

8862 4 чают количество фибриногена (мг ) в плазме крови.

При отсутствии спектрофотометра количество белка после растворения сгустка можно определить другим общепринятым методом, например по методу Лоури.

Предлагаемый способ применим и для определение фибриногена в плазме больных,, подвергающихся лечению гепарином. В это

10 этом случае в пробу за 5 мин до внесения тромбина прибавляют протаминсульфат для связывания гепарина. Количество вносимого протаминсульфата зависит QT качества используемого препарата и со35 держания гепарина в исследуемый плазме.

Так, при содержании гепарина в количестве 10 ед/мл плазмы, протаминсульфата (фирмы "Спофа" ЧССР) вносят 0,24 мг в пробу.

Предложенный способ требует немного времени — 40-50 мин, по сравнению с известным затрата времени. уменьшается в 4-5 раз. Мутность растворов незначительная, поэтому точность получаемых результатов высокая.

Предложенный способ дает отклонение, не превышающее 3%, а известный способ — до 16 .

Формула изобретения

Способ количественного определения фибриногена в плазме крови путем добавления фосфатного буфера, инкубирования смеси с тромбином, извлечения сгустка

35 фибрина, промьгвки, растворения и опре-деления количества белка, о т л и ч а— ю ш и и с я тем, что, с целью повышения точности и ускорения определения фибриногена, добавляют в смесь плазмы с фосфатным буфером раствор монойодоуксусной кислоты, инкубируют смесь с тромбином, содержашим ионы кальция, . а отмытый сгусток растворяют в 1,5%ной уксусной кислоте, "взятой в количестве (20-25):1 по отношению к исследуемой плазме.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Biduell Е. uTibrinlysis of Haman Plasma А. comparison of fibrinolytic plasma from normal subiect and

from cadaver blood with plasmin prepared by activation with ohloroform

"Вiochem iсеl Journal ". ч. 55, 1955, 55. рр. 497-506.