Способ получения комплекса целлюлолитических ферментов

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик р11983141 (61) Дополнительное к авт. саид-ву(22) Заявлено 290681 (21) 3307248/28-13

151) М. Кю.

С 12 г 9/42 с присоединением заявки ¹

I.Государственный комитет

СССР ио делам изобретений и открытий (23) ПриоритетОпубликоваи(з 23.128р Бюллетень № 47

153) УДК 577.15 (088.8) Ъ

Дата опубликования описания 23 ° 12. 82

« ««« ая Й:- И .-М.Малиновская (72) Авторы изобретения

Н.A.Ocòðèêoâà, С.A.Êîíoâàëîâ, М.В.Покров

1:» всесоюзный научно-исследовательский био ехничйскИй . институт

« (71) Заявитель 5 4 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ

ФЕРМЕНТОВ

Изобретение относится к ферментной отрасли микробиологической промышлен-. ности и может быть использовано для гидролиза целлюлозосодержащего сырья в кормопроиз водстве йри силосовании грубых кормов, в пищевой промышленности, а также для получения сахаристых растворов из отходов пищевой и деревообрабатывающей промышленности.

Известен способ получения микробного белка пуТем культивирования смешанной культуры Се11ulomonas sp.

А1са1igenes fаса1 is. Приводится одновременный .посев обеих культур на питательную среду, содержащую rpo" дукты .щелочного гидролиза измельченных городских и сельскохозяйственных отходов, и их дальнейшее выращивание при 30оС (1 ).

Недостатком этого способа явля,ется то, что культивирование не сопровождается накоплением фермента.

Известен способ получения целлюлозы и микробного белка, предусматривающий совместное культивирование глубинным способом Тгichodeгма ч1r1,de 44 и дрожжей при одновременном внесении посевных культур микроор- . ганизмов в ферментационную среду.

Культивирование осу -;ествляется прн

30оC в течение 7-13 сут (максимальное накопление белка и целлюлазы на десятые сутки ) (2).

Однако полученный комплекс фер ментов практически не содержит целлобиаэу и пектинаэу, необходивьте для наиболее полного гидролиэа целлкитозо-.. содержащего сырья., Недостатком способа является также длительность культивирования.

Цель изобретения — полный и экономичный гидролиз целлюлозосодержащего сырья,и сокращение сроков куль15 тивирования продуцентов.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения комплекса целлюлолитических ферментов, предусматривающему совместное культивирование двух культур глубинным способом, совместному культивированию подвергают культуру гриба Aspergi11us foetidus И-45 — продуцента целлобиазы и пектиназы и культуру гриба Тгichoderma viride йй — про» дуцента целлюлазы, причем в последнюю вносят первый продуцент в конце зкспоненциальной фазы роста и продолжают совместное культивирование

ЗО в течение 3-6 суток.

983141

При культивировании гриба Tr i choderma ч! гl;de происходит синтез. "собственно" целлюлаэы, в комплекс которой входят эндоглюканаза, экзоцеллобиогидролаза и экзоглюкозидаза.

Этот комплекс целлюлазы обеспечива- е ет гидролиз целлюлозы до целлобиозы, а также до олигосахаров. Указанный микроорганизм практически не синтезирует целлобиазу и пектиназу.

Культура Aspergl1lus foetidue . 10 синтезирует в очень незначительных количествах целлюлазу, но в то же вре мя активно образует целлобиазу и пектиназу.

При. внесении в питательную среду 15 посевного материала одновременно двух указанных культур между ними происходит конкуренция за лимитирующий субстрат, в результате которой AspergiI1us foet!dus задерживает рост

Trichoderma чi rlde. Для обеспечения интенсивного синтеза всего комплекса ферментов необходимо культуру

Aspergi11us foetldus вносить в культуральную жидкость после окончания 25 роста Trichoderma viride. Таким образом, в начальном периоде сов местного выращивания смешанной куль туры Trichode геа чl ride находится в стационарной фазе роста, а Aspergll1usfoetIdus - в экспоненциатьной.

В этих условиях начинается синтез одновременно целлюлазы, целлобиазы и пектиназы.

Получен щй ко""лекс ферментов поз-35 воляет разрушать целлюлозу различного растительного сырья до глюкозы.

П р и м.е р 1. Посевные культуры

Trlchoderma ч!г10е 44 и посевную культуру AspergiIIus foetldus М-45 вносят одновременно в жидкую питательную 40 среду следующего состава, ii: свекло-.. вичный жом 5,0; дрожжи БВК. 0,5, сернокислый аммоний 0,4; калий фосфорнокислый однозамещенйый 0,2 и магний ,.сернокислый 0,03. РН среды 4,5-4,7. 45

Культивирование ведут при 2830 С, аэрировании 1 объем/объем/мин и перемешивании 300 об/мин. Через б сут совместного культивирования активность целлюлазы составляла 50

2,0 ед/мл (метод Сомоджи-Нельсона), целлобиазы- 40 ед/мл (глюкозооксидазный метод), пектиназы - 1,2 ед/мл (ГОСТ 202б4.3.74 )..

Пример .2 ПосевнУю культуру 55

Тг lchoderma vl ãИе 44 вносят в жидкую питательную среду состава, ука.эанного в примере 1. Через 1 сут выращивания вносят посевную культуру- Asperglllus foetidBs М-45 и про- <0 ,должают культивирование одновременно двух культур еще 5 сут при том же режиме. .ВНИИПИ Заказ 9838/3

Филиал ППП "Патент", r

Через 5 сут совместного культивирования активность целлюлаэы составляла 11,5, целлобиазы — 38 и пектинаэы — 1,2 ед/мл.

Пример 3.В питательную среду состава, указанного в примере 1,вносят посевную культуру Trichoderma viride 44, Через 3 сут выращивания еще вносят посевную культуру Aspergl11us foetidus М-45 и продолжают совместное культивирование еще 3 сут при том же режиме. Через 3 сут сов местного культивирования активность целлюлазы составляет 17,2, целлобиа.,зй - 25 и пектиназы — 0,6 ед/мп.

Предлагаемый способ позволяет получить в условиях одной фермен. тации комплекс ферментов, состоящий из целлюлаэы, целлобиаэы и пектиназы, т.е. ферментов, участвующих в гидро 0лйзе целлюлозосодержащего сырья до конечного продукта - глюкозы.

Кроме того, изобретение сокращает расход сырья,.а также дает возможность экономить топливно-энергетические ресурсы за счет проведения одного смешанного культивирования вместо двух раздельных, а также снизить расход растворителя, используемого дня осаждения ферментов.

Таким образом, реализация изобретения позволяет осуществить полный и экономичный способ гидролиза целлюлозосодержащего сырья и сократить сроки культивирования пропуцентов до 4-7 сут. .! формула изобретения

Способ получения комплекса целлюлолитических ферментов, предусматривающий совместное культивирование двух культур, глубинным способом, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью обеспечения полного и экономичного гидролиза целлюлозосодержащего сырья и сокращения сроков культивирования продуцентов, совместному культивированию подвергйот культуру гриба Aspergi llu s foetidus M-45( продуцента целлобиазы и пектиназы и культуру грИба Trichoderma viride

44 - продуцента целлюлазы, причем в последнюю вносят первый продуцент, в конце экспоненциальной фазы роста и продолжают совместное культивирование в течение 3 - б сут.

Источники информации, принятые во .внимание при экспертизе

1. Srinlvasan. V.R ° Single -,се11

protein from waste ce1lBlasa. Lou i s I ana

state UnI vers 1 ty, 1973, р. 81.

2. Peterson N. Се11и1авв and

protein production from mixed сиlt«res of Тгichoderma чlride and . yeast - Biotechnoloqy and Bloengenee r I ng, 1975, )„7, 9., 1291-1299 (прототип).

0 Тираж 505 Подписное . Ужгород, ул.Проектная, 4