Штамм @ @ @ / @ /,используемый как тест-объект для отбора химических соединений,активных в отношении нитрофураноустойчивых микроорганизмов

 

Штамм Esche ichia coli К12 /рШ1р5/,ЦМПЦВ-2164 (Ъннигенетика) , нш1ольэуемБ1й ка твст-рбт ект ддя отбора химшческих соединений, активных в отясшенни фураноустойчивых микроорганизмов .

(19) (И) СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

М9 С 12 N 15 00.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ к авто сно свид альстау .

ГОСЗЯАРСТОЕННМЙ КОМИТЕТ СССР

nO pm AM 14ЗОБРЕТ ЕНИй 14 СТ (Р (Т)4й (21) 3351160/28-13 (22) 01.07.81 (4б) 23 .05,83. Бюл. М 19. (72) S.A.Øåíäåðîâ, H.A.Оленина и А А, Лушников, (7X) Саратовский ордена Трудового

Красного Знаиени государственный медицинский институт. . (53) 576,8. 093 .(088 ..8) ..(5б) 1. Ао Ki T., Eguse 5. Arai T.

:Reducect4 nitr0furan sensitivity соаУехгес by. R. factors. — ).М1сгоЫо:.1ОЯ,4арад, 1975 19f4 j pp327-329. г,(54) ШТИХ .БЯС 1ЕВ1СН1А C0l.l

R 12/р L 01 0 5/ ÈÑÏÎËÜÇßÈÛÉ XAK ТЕСТ.

ОБЪЕКТ ДНЯ ОТБОРА ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ АКТИВНЫХ L ОТНОШЕНИИ НИТРОФУРАНОУСТОЙЧИНЯХ МИКРООРГАНИЗМОВ ° (57) Штамм БвсЬеЫсп1а eeli Kl 2 /рЬ0105/,.ЦИПЩ3-2164 (ВНИИГенвтика), используемый ка тест-объект для отбора химических. соединений, активных в отношении Фураноустойчивйх микроорганизмов.

1018972

Изобретение относится к микробиологии и касается нового штамма микроорганизмов, используемых для отбора эффективных химиотерапевтических препаратов, активных против нитрофуранореэистентных бактерий, 5

Известен штамм Еscheг!eh!â со!i

Rc 85,несущий трансмиссивные Й-плаэ» миды (R6K,рЯА5082, plA5017, р А4733 или(р jA4320) (11.

Однако известный штамм обладает 10 множес венным характером трансмиссион-,ной лекарственной усгойчивости,при этом R-факторы наряду с детерминан-тами нитрофуранорезистентности несут маркеры устойчивости и к дру» гим антибактериальным препаратам.

Цель изобретения — создание штамма .Escheiichia(cali К 12/р10105/ обладающего такой степенью трансмиссивной устойчивости к препаратам р0 нитрофуранового ряда, которая позволяет использовать его как тестобъект для отбора химических соединений, активных в отношении нитрофураноустойчивых микроорганизмов.

Штамь; Escherichias coli K12 ./pLDl05/ получей методом конъюгации музейного штамма Еsche.ãiсhiа!, coli К 12 str" и клинического штамма .ЕэсЬег1сЫа! со11 92 fc"fg fr " и последующей селекции трансконъюгантов на среде с фурангином (20 мкг мл) .

Штамм хранится в Центральном музее промышленных микроорганизмов института ™ВНИИГенетика под номерам З5

ЦМПМВ-2164.

Штамм Е.coli K 12/pLD105/ характеризуется следующими свойствами.

Морфологические признаки.

Клетки суточной культуры пряМые 40 палочковидные размера (2-5)х(0,5-/

0,7)мк,подвижные,грамотрицательные.

Культуральные свойства.

Прототрофный штамм, хорошо растет 45 на простых питательных средах.

Мясо-пептонный агар: колонии в

OR-форме, неправильные, плоские,крупные (3-5) мк с .плотным центром и-проз рачные по периферии. Поверхность mepo50 ховатая, край фестончатый, структура зернистая, консистенция рыхлая. На среде Эндо образует подобные колонии с металлическим блеском. Мясо-пептонный бульон: крошковидный придонный рост, пленка на поверхности, npocseтление среды.

Виохимические свойства.

Дает положительную реакцию с мети-. ловым красным, »е образует ацетилметилкарбинол„ Не утилизирует цит- 60 рат, ферментирует глюкозу,лактозу, маннит, мальтозу, дульцит, сорбит, арабчнозу, рамнозу, ксилозу,глицерин, не ферментирует сахарозу, инозит, раффинозу, желатич не разжижает. 65

Г Образует индол, не образует сероводорода, не расщепляет мочевйну.Декарбоксилирует лизин, глутаминовую кислоту и не активен в отношении аргинива орнитина и фенилаланина.

Не обладает антагонистической и ° гемолитической активностью.

Полученный штамм Е.coli К12

/pLDl05/ может быть практически использован как тест-объект для отбора химических соединений, активных в отношении нитрофураноустойчивых микроорганизмов в ограничивающих распространение этого признака, а также для конструирования штаммов бактерий других видов с плазмидной устойчивостью этого типа.

Плаэмида pDD105 обладает Fin+ фенотипом. Клетки штамма Е.coli К 12, воспринявшие ее при конъюгации, приобретают донорную активность, хотя характеризуются нечувствительностью к фагам F,L,р,специфичным для штаммов с плазмидами 1пс,F,Inc,JncP групп.

Они передают признаки Fc (фурацилин), Fg (фурагйн),Fz (фуразолидон) при повторном скрещивании реципиентному штамму Е.coli В с частотой,.сравнимой с частотой передачи тийичных

R-плаэмид (табл. 1).

Вместе с маркерами нитрофураноустойчивости наблюдается перенос и хромосомных генов донора, контролирующих синтез аминокислот (leu,pro

trp,hie,lys,i1v).

Плазмиды, контролирующие устойчивость к производным 5-нитрофурана, стабильно сохраняются штаммом Е.coli

К12 /pLD105/ в течение четырех лет при поддержании микроорганизма на среде без соответствующих препаратов при 4 С. Популяционный анализ штамма в отношении чувствительности к фурацилину., фурагину и фуразолидону выявлет незначительную спонтанную потерю указанных детерминант. Элиминация плазмид может быть усилена акрифлави.,гом.

Выделение плазмидной ДНК из полученного штамма осуществляют с помощью метода центрифугирования вградиенте плотности хлористого цезия.

Анализ образца плазмидной ДНК, вьщеляемей из штаммов Е.со,li К12

/pLD105/, обнаруживают присутствие трех групп плазмид: основной с мол. весом 30,7+0,81 мегадальтон,дополнительной — 33,9+0,2 МД, кроме того, выделяется ряд молекул с мол.весом

8 9 — 10,1 МД.

Пример l.уровни устойчивости к нитрофурановым препаратам определяют методом серийных разведений в плотной питательной среде. Изучаемые химические соединения (S-алкилсульфониевые соли 2-тиабициклоалканов) растворяют предварительно в диметилформамиде, а затем разводят

Составитель П.Бонарцев

Редактор P.Öèöèêà ТехредМ.Костик Корректор О. Билак

Заказ 3636/20 Тираж 523.. . . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета. СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 в мясо-пептонном бульоне. В качестве тест-культуры. используют штамм

Escherichla coli К12 pLD105/.

Пример 2. Конструирование штаммов бактерий с плазмидной устойчивостью к нитрофуранам. 5

Штамм E coli К 12/рЬ0105/ используют.в качестве донора в опытах конъюгационного переноса признака нитрофураиорезистентности. Реципиентом служит штамм E.coli В,чувствитель 10 ный к нитрофуранам, Суточные бульонные культуры донорного и реципиентного штаммов разводят с.вбежим мясо-пептонным бульоном s 10 раз и инкубируют при 37 С. Культуры, взятые в фазе логарифмического роста, смешивают в . отношении. l:10. После 20-часовой.ин кубации конъюгационной смеси при 37 С отбирают пробы (0,5 мл), которые высевают иа мясо-пептоиный агар, содер-.О жаший фурагин и фураэолидон в концентрации 20 мкг/мл н рифампицин — 500 мкг/мл. Учет результатов проводят через 48 ч инкубации пссевов при 37 С.

Частота формирования траисконъюгантов не зависит от селектнвного агента и сравнима с частотой передачи типичных P-плаэмид.

П р и M е р 3. Мобилизация хромосомных генов.

Мобилизацию генов, контролирующих синтез аминокислот, изучают у пред- лагаемого протрофного штамма E,cali

К 12/pLD105/F R в кроссах с рециииентными полиауксотрофными Ц -auxaaa мами Е.coli j 62 и KS/4. Конъюгацию осуществляют о описанной методике (пример 2) ° Рекомбинатщ цо хромосомным маркерам leu, pro,tpr,his,, !уз, )ч селекционируют на минимальной среде Ледерберга с рифампицином (50 С мкг/мл) и соответствующими аминокислотами (20 мкг/мл). Перенос хромосомных генов R-плаэмидой

pLD105 рецепиеитным штаммам в описанных условиях опыта осуществляет« ся с частотой 10 — 10 на клетку реципиента.

Таким, образом, предлагаемый штамм E.coli K12/pLD105/ несет трансмиссионную плазмиду нитрофуранорезистентности, контролир1аощую устойчивость к группе соединений,не имеющих аналогов в природе, что выгодно отличает ее от других R-плаз- . мид и делает перспективной векторной системой в генной инженерии.