Штамм бактерий @ @ 24-продуцент эндонуклеазы

 

Штамм бактерий Serratia mafcescens 2 (коллекция Центрального музея прокшшленных микроорганизмов института ВНИИгенетика, коллекционный номер ЦМПМ В-2379) - продуцент эндонуклеазы. i (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ.

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

09) И1) ГОСУДМРСТВЕННЬЮ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTQPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ )

1 (21) 3384236/28- 13 (22) 01. 12. 81 (46) 30.06.83. Бюл. N 24 (72) Д.В. Юсупова и P.Á. Соколова . (71) Казанский ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина (53) 574 15 (088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР

Ю 302367, кл. С 12 я 1/20, 1969.

2. Авторское свидетельство СССР

Ю 34069 1, кл. С 12 g 1/20, 1970 (прототип ) . аа С 12 9/22; С 12 g 1 0 (54) ВТАИИ БАКТЕРИЙ SERRATlA MARCES-

CENS 24 - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ, (57) Штамм бактерий Serratia шагсевcene 24 (коллекция Центрального музея промышленных микроорганизмов . института "ВНИИгенетика", коллекционный номер ЦИПИ В-2379) - проду: цент эндонуклеазы.

Штамм Serratia marcescens 24 имеет следующие характеристики.

Морфологические признаки. Клетки палочковидные размером 1,5-2,0 0,8-.

1,0.ц, одиночные, парные или соединенные в цепочку, грамотрицательные, подвижные °

Культуральные признаки и физиологические свойства. На МПа через 24 ч роста колонии блестящие, около 1,52,0 мм в диаметре, бесцветные, гладкие. Профиль колонии выпуклый, края ровные. На картофеле дает блестящий белый налет. Желатин разжижает медленно, молоко свертывает, но не пептонизирует.

Из глюкозы, сахарозы, мальтозы, ксилозы, сорбита, инозита, маннита образует кислоту. На лактозе кислота не образуется, Утилизирует цитрат натрия в качестве единственного источника углерода, сероводород ° Индол не образует. Реакция фогес-Проскауера слабо положительная. Реакция с метилрот положительная.

Нитраты восстанавливает до нитритов.

Оптимальная температура роста

28-30 С, рН среды 7,4-7,6.

Нуклеазная активность через 48 ч достигает 80000-90000 виск. ед/мл или 21-25 мкМ/мл/мин. Нуклеазную буфера рН 8 5; 0,007 М 8+04 0,1 мл культуральной жидкости. Реакционную смесь инкубируют 15-30 мин при 37 С.

Реакцию останавливают добавлением

М-ного раствора охлажденной HC6Q в объеме, равном объему реакционной смеси.

Кислотонерастворимый материал удаляют центрифугированием на холоду при 6000 0 20-30 мин. В надосадочной жидкости после разведения в 20 раз

О 5

0 5

0 ° 5

3а единицу активности принимают коли чество фермента, которое дает увеличение оптической плотности в опытных образцах по сравнению с контрольными (реакционная смесь без фермента) на .

55 одну опт. ед. за час инкубации B

1 1025725 2

Изобретение относится к микробио логической промышленности, а именно к новому штамму микроорганизмов, в .частности Serratia marcescens 24продуценту неспецифической внеклеточной эндонуклеаэы (К ° Ф 3 ° 1 ° 4 ° 9), который используется в эксперименталь" ных исследованиях по изучению противоопухловых и противовирусных свойств эндонуклеаэы, в ветиринарии в качест- 10 ве лечебного препарата против вирусных заболеваний насекомых, для получения 5-дезоксирибомононуклеотидов и др.

Известны штаммы ВеггаС a шагсев- i5 еепв — продуценты эндонуклеаэы, пигментный Ви-211 АТСС 9986 1. 13, Активность фермента невелика и составляет 4000-6000 виск. ед/мл.

Наиболее близким к предлагаемому 20 по технической сущности и достигаемому результату является штамм

Serrat ia marcescens 44 — беспигментный продуцент нуклеазы $ 2)

Активность фермента равна 50- 25

60 тыс. виск. ед/мл белка или 7,5 мкм расщепленного субстрата ДНК в 1 мин/

/мл.

Недостатком известного штамма является низкая активность продуциру емого фермента. выращивания на качалке (180-200 об/

Чель изобретения — получение штам- /мин) при оптимальной температуре ма Serratiamarcescens, отличающегося от известных более высоким уровнем эндонуклеазной активности.

Штамм получают методом рассева на мясо-пептонном агаре пигментного штамма Serratiamarcescens Вй-211

ЯТСС 9986 с последующим отбором колоний снаибольшей ДНКазнойактивность

Для получения эндонуклеазы штамм

Herratia marcescens 24 выращивают на среде следующего состава, г/л:

Глицерин 5,0

Цитрат аммония 5,0 45

Двузамещенный фосфат калия 10,0

Сернокислый магний

Хлористый на- 50 трий измеряют оптическое поглощение при

Сернокислое 260 нм на спектрофотометре Сф-16. железо

Гидролиэат казеина l,0

Дрожжевой экстракт 3,0 рН среды 7,6.

3 1025725

4 пересчете на 1 мл культуральной жид- Сравнительная характеристика актикости (A26o ep/va/v), вности внеклеточной эндонуклеазы

В качестве субстрата используют штаммов Serratia marcecens иэвестпрепараты высокойолимерной ДНК, вы- ных и предлагаемого в качестве проду деленной из тимуса теленка .по методу 5 центов нуклеазы на известной питаКэя в модификации Бенинга или коммер- тельной среде для получения нуклеазы ческие препараты высокополимерной ДНК. представлена в таблице.

Активность нуклеазы в культуральной жидкости

Штамм виск.ед/мл опт.ед./мл/ч мкМ расщепленной

ДНК/мл/мин

Известный

$еггат,1а

marcescens

41 (пигментный) 1

1000

160

0 5

Serratia

marcescens

Вй-211 АТСС 9986 (пигментный) 1,0-1,5

4000-6000

720-960

Serratia

marcescens

44 (беспигментный) 8500-9950

50000-60000

14,0-16,5

Предлагаемый

$еггаЫа

marcescens

24 (беспигментный) 80000-90000

13000-15000

21,0-25,0 образующего штамма показывает, что эндонуклеазная активность беспигментных штаммов в 3-20 раз выше активности исходного штамма.

Наибольшей эндонуклеазной активностью обладает беспигментный штамм

Serratia marcescens 24.

Пример 1 . Получение штамма с повышенной эндонуклеазной активностью.

Исходный пигментообразующий штамм

Вй-211 АТСС 9986 выращивают на мясопептонном агаре в течение 1 сут при 45

28 С ° Выросшие клетки смывают

0,5ã.-ным физиологическим раствором и рассеивают на чашке Петри с мясо-пептон. ным агаром иэ расчета 200-300 микроб. ных клеток на чашку. Посевы выдерживают в термостате в течение 2-3 сут„при 28 C. Все беспигментные колоо нии, выросшие на чашках, отсевают в пробирки с ИПа. Посевы хранят при комнатной температуре.

Сравнительное изучение эндонуклеазной активности полученных беспигментных штаммов и исходного пигментоПример 2 . Использование штамма в качестве продуцента эндонуклеазы., Подготовка посевного материала.

Культуру Serratia marcescens 24 выращивают в течение 1 сут в пробирках со скошенной средой вышеуказанного состава, смывают 0,53-ным физиологическим раствором и засевают в две колбы с 200 мл жидкой среды в каждой иэ расчета 1 мл инокулянта

10257

25!

Составитель И. Привалова

Редактор А. Огар Техред А.Ач Корректор Г. Решетник

Заказ 4497/20 Тираж 523 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035„ Москва, Ж-35, Раушская наб., д. Q5 филиал ПИП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная„ 4 г

Э на 100 мл. среды, выращивают на качалке (200 об./мин ) в течение 12 ч.

Полученный -таким образом посевной ма" териал засевают в ферментер РИ4-30 с 18 л среды. 5

Выращивание проводят в оптимальных для образования нуклеаэы условиях:

Исходный рН среды 7,6

Температура, С 28

Аэрация, л воз-. духа/и среды/мин 1:1

Перемешивание в течение, ч 36

Через 36 ч ферментации активность нуклеаэы в культуральной жидкости до- iS стигает 80-90 тыс. виск, ед/мл или

21 25 мкМ расщепленной ДНК на 1 мл в минуту. Культуральную жидкость насыщают сульфатом аммония до 209;.

Выпавший при 4 С осадок вместе с бак" териальными клетками отделяют центрифугированием и отбрасывают. Надосвдочную жидкость повторно насыщают сульфатом аммония до 904, оставляют при 4ОС на 10-.18 ч. Затем осадок отделяют при 60000ц на рефрижератор" ной центрифуге, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, подвергают диализу и очистке на ДЭАЭ-целлюлозе и фосфоцеллюлоэе, На всех этапах определяют нуклеазную активность вискозиметрическим методом и по продуктам гидролиза высокополимерной ДНК, растворимым в 2Ж-ной НСРОд, определяемым по поглощению при 260 нм.

Полученный штамм отличается от исходного Вй-211 AТCC 9986 отсутстI вием пигмента, большими размерами клеток, более медленным разжижением желатина, слабой реакцией Фогес-tlpo-. скауера, положительной реакцией с метилрот. Нуклеаэная активность штамма 24 в 20 раз превышает активность исходного и в 1,5 раза штамма 44.

Использование предлагаемого штамма Serratia marcescens 24 в качестве продуцента эндонуклеаэы позволяет повысить нуклеазную активность за период одной ферментации на 603 по сравнению с культивированием на той же среде известного штамма Serratia

marcescens 44, что удешевляет процесс получения сульфатаммонийной фракции фермента на 403.