Способ получения метиониназы

 

{72} Авторы изобретения

Т.Т. Березов (СССР), Сода Кении, Есаки Нобуй

Шугие Кунио (Япония) @ 3%, ч вью а .

1й

Университет дружбы народов им. Патриса Луну

-J и ТЕП У0

{ 7 l } Заявитель

БЩ ДО /Pi (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЕТИОНИНАЗЫ

- Изобретение относится к биохимии, а именно к методам выделения и очистки ферментов из микроорганизмов, и может быть использовано в энзимоло-- гии.

Известен способ выделения метиониназы 2-метионин-у-лиазы из культуры, Cfostridium sporogenes, включающий весть стадий очистки фермента tl j.

Недостаток данного способа — не=-=— -i6 большой выход фермента и незначительная степень очистки.

Известен также способ получения метиониназы из- культуры Pseudomonas

ovalis включающий получение грубого экстракта, хроматографию.на ДЭАЗ-целлюлозе с элюцией 0,05- И фосфатнымбу фером, содержащим пиридоксальфосфат и-меркаптоэтанол, осаждение 20-503 сульфатом аммония, вторичную хрома- р0 тографию на.,ДЭАЭ-целлюлозе с элюцией тем же буферным раствором, осаждение .

503 сульфатом аммония, тепловую об- - . работку, хроматографию на гидроксил2 аппатите, хроматографию на ДЭАЗ-сефадексе с элюцией 0,02 И калий,фосфатным буфером, с добавлением О,l И хлористого калия и хроматографию на сефадексе G-200. Конечный выход ме" тиониназы 73 $2).

Однако известный способ не приводит к получению фермента с высокой удельной активностью. Кроме того, способ сложен, так как включает большое число операций.

Целью изобретения является повы-. шение степени очистки и активности фермента, .а также ускорение способа получения метиониназы.

Поставленная цель достигается тем, что, при осуществлении способа получения фермента путем экстракции куль". туры Pseudornonas putida с последующим выделением целевого продукта хроматографией экстракта на ДЗфЗ-целлюлозе, хроматографией на.ДЭАЗ-сефадексе и гельфильтрацией элюцию при хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе осу3 99455 ществляют пиридоксальфосфатным бу" фером с градиентом хлористого калия от 0,12 до 0,18 М, а элюцию при хро-матографии на ДЭАЭ-сефадексе проводят пиридоксальфосфатным буфером с градиентом хлористого калия от 0,2 до 0,4 М, а очистку целевого продукта дополнительно проводят хроматографией на колонке с ДЗАЭ-целлюлозой.

Способ осуществляют следующим об" разом.

Полученный бесклеточный экстра! т после разрушения микроорганизмов под". вергают хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе и после элюзии из колонки линейным градиентом хлористого калия от 0,12 до 0,18 М активные фракции, после диализа в течение 16 ч, вновь подвергают хроматографии на колонке с ДЭАЭ-сефадексом (A-50). Фермент элюируют градиентом хлористого калия от 0,2 до 0,4 M.

При концентрации хлористого калия менее 0,2 M не происходит элюирование фермента, но элюируются другие балластные белки. В собранных фракциях определяют активность метиониназы. Активность была сосредоточена в пробах от N 45 go N 80. Эти пробы объединяют и диализируют против пиридоксельфосфатного буфера.

Активные фракции подвергают вторичной хроматографии на колонке с

ДЭАЭ-целлюлозой. Элюзию проводят линейным градиентом хлористого калия от 0,12 до 0,18 И. На заключительном этапе обессоливают целевой. продукт методом гель-хроматографии, используя гель Тойоперп HM-50 или Сефадексы типа G-25, G-50, G-75.

Пример. Культуру Pseudomonas.

putida !F03738 выращивают на среде следующего состава, 3: Z-метионин

0,25; мочевина 0,1; глицерин 0,1;

КН2РО 0,1; K2HPOg 0,1;.МфО,!. 7Н20

0,01; дрожжевой экстракт 0,025. Куль- туру выращивают при- 28 18 ч с аэрацией. Клетки отмывают дважды раствором 0,85io ного МаСЕ, а затем 0,01 M фосфатным буфером (ph 7,2), содержащим l0 М и пиридоксаль-S-фосфат и 0,013 2-меркаптоэтанол. Клетки (150 г) разрушают и суспендируют в том же буферном растворе.

Супернатант диализируют в течение 21 ч против вышеуказанного буфера. Образующийся осадок удаляют центрирфугированием. Полученный грубый экстракт объемом 2500 мл с удельной активностью 0,07 нмоль наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой.

Элюирование .фермента проводят КСР (0,12 М) в течение суток, затем постепенно заменяют на более концентрированный раствор КСР (0,18 М).

Элюируют калийфосфатным буфером 0,1 И (Ph 7,2), содержащего 2.10- М пиридоксальфосфата„ 0,013 меркаптоэтанола и 0,04 этилендиаминтетраацетата (ЭДТА).

Первый раствор элюирует балластные белки, а второй - фермент метиониназу. Диализ проводят против пирофосфатного буфера.

После диализа раствор фермента переносят на колонку с ДЭАЗ-сефадексом (А-50). Сначала элюируют балластные белки пирофосфатным буфером в присутствии О, 1 M КСЕ (1 л). Затем увеличивают концентрацию КСЕ до

0,2 М и подключают коллектор фракции. Активность фермента определяют в пробах, а затем подключают градиентную элюцию раствором пирофосфатного буфера с возрастающими концентрациями КСР (от 0,20 до 0,40 M). В собранных фракциях (по l3 мл) определяют активность метиониназы. Ферментная активность была сосредоточена в пробах от N 45 до Ф 80.

Объединенные пробы с У 45 до Г 80 (общий объем 550 мл). После диализа переносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой. Колонку промывают 500 мл калийфосфатного буфера, содержащего пиридоксальфосфат и меркаптоэтанол, но не содержащего ЭДТА. Затем колонку промывают последовательно 0,07 М (500 ) КСЕ и 0,12 М (500 ) КСЕ.

Элюирование проводят градиентной элюцией с 0,12 М по 0,18 M KC9 (600 мл), собирая пробы по 6 мл в каждой пробирке. Во всех пробах определяют активность метиониназы.

Наибольшая активность фермента была сосредоточена в пробах с И 50 по

Н 104.

В зависимости от активности фермента пробы объединяют в 3 объема, в каждом из которых определяют общую активность фермента. Из каждого объема берут пробы для диск-электрофореза.

Все три объема подвергают гельфильтрации через колонку с Тойоперл (НИ-50). Злюирование проводят калийфосфатным буфером (рЬ 7,2), и актив5 - 994554 6 ные фракции, содержащие целевой про- в минуту), выСокой степенью очистки дукт, объединяют. и за меньшее число операций.

Предложенный способ позволяет по- В таблице приведены сравнмтельлучать фермент с высокой удельной ные данные сопоставительногО анализа активностью (19,1 мкмоль/кг белка предложенного и известного способов, Общая активность, мкмоль/мин

Удельная активность, мкмоль/кг белка/мин

Выход, Степень очистки

Способ

274 3

Предлагаемый

329,2

19, 1О

10,1

Известный

410

1.,810

Формула изобретения

Составитель А. Донцев

Редактор М. Дылын Техред С.Мигунова Корректор Н. Король, Заказ 565/7

Тираж 521 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Способ получения метиониназы путем экстракции культуры Pseudomonas

putida с последующим выделением целевого продукта хроматографией экстракта на ДЭАЭ-целлюлозе, хроматографией на ДЭАЭ-сефадексе и гельфильтра,цией, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа, повышения активности и степени очистки фермента, элюцию при хроматографии на ДЗАЗ-целлюлозе осуществляют пиридоксальфосфатным буфером с градиен- . том хлористого калия от 0,12 до

О, 18 М, а элюцию при хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе. проводят пиридоксальфосфатным буфером с градиентом

zo хлористого калия от 0,2 до 0,4 И, а очистку целевого продукта дополнительно проводят хроматографией на колонке с ДЗАЗ-целлюлозой.

Источники информации, 25 принятые во внимание при экспертизе

1. Kreis M.,Hessio С. Biological

Effects of enzymatic deprivation on -t

L-methionine in cell culture on

experimental tumor. Сапсег Res., 33, Эо 1866-1869, 1979.

2. Tanaka Н., Esaki М;, Vamambto Т., Soda К, Pur i f l ñà t i on and properties of МейП!оп1пазе from Pseudomonas ovalis. FEBS Letters, бб, 307з5 311, 1976.