Способ определения моноаддуктов и диаддуктов днк

 

ССНОЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

И5 с 12 к ы оо

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСНОМЪ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

По ДЕЛАМ. ИЭОБ ЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3262236/30-15 (22) 29.12.80 (46) 15.07.83. Бюл. _#_e 26 (72) О. В. Евграфов, Г. П. Македонов, А. Р. Федотов и Ю. Г. Тиняков (71) Институт обшей генетики AH СССР (53) 574.963.3 (088.8)

: (56} 1kanson С.V. et al. Cross-1in- king ot DNA in situ as a probe for

chromatin structure. - Science, N 4247 рр. 62-64, 1976

2. Cole R. Psoralen monoadducts

and interstrand cross-links in

0NA;88A, 254, v. 1, р. 30-39, 1971 (54) (57) СПОСОВ ОПжДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА МОНОАЩ1УКТОВ И DHAQ,ПУКТОВ .ДНК, включающий выращивание

ÄÄSUÄÄ 1028719 А культуры клеток на питательной среде, препаративное выделение QHK, установление концентрации ДНК, инкубацию препарата EIHK с вешеством фурокумариново го ряда, сепарацию полученного продукта, облучение его ультрафиолетовыми лучами, денатурацию его физическими и химически ми средствами, регистрацию диаддуктов, о т л и ч а ю ш и и с я тем, что, с целью повышения точности и упрощения способа, при инкубации препарата gHK c вешеством фурокумаринового ряда в качестве препарата ДНК используют натив ную OHK с последующим облучением ультрафиолетовыми лучами, для регистра ции моно-пиаддуктов используют электронную микроскопию, а количество моноад1 дуктов рассчитывают.

Изобретение относится к способам определения первичных, неферментатив ных повреждений llHK, в частности фуро кумариновых моно- и диаддуктов QHK, . преимущественно 8-метоксипсораленовых, моно- и диаддуктов DHK.

Изобретение может быть использовано в исследованиях по изучению фотохимических процессов связывания молекул ДНК с веществами фурокумари- IO нового ряда, для изучения структурно функциональной организации хроматина и хромосом, а также молекулярных механизмов мутагепеза и репарации. Изобретение : может быть использовано в прикладных 15 .целях при разработке тест-систем: опрецеление мутагенов окружающей срейы, промышленных мутагенов, контроля на мутагенность лекарственных и химичес ких препаратов. 20

Известен способ опрецеления диаддукI тов ДНК для анализа стурктуры хроматина, согласно которому диаддукты дНК регистрируют в электронном микроскопе в виде сшивок ДНК (Ц . 25

Наиболее близким к изобретению является способ определения количества псораленовых моно- и диаддуктов QHK-(23)

Этот способ основан на выращивании клеток на питательной среде, содержащей 30 р, препаративном выделении ДНК, установлении ее концентрации, инк бации с меченым рациактивным изотопом Ц триоксаленом, ультразвуковом фрагментировании препарата ДНК, сепарировйнии массы QHK на порции, облучении ультрафиолетовыми лучами, разделении хромотаграфическим способом оцнонитевых и двунитевых фрагментов lIHK, установлении концентрации QHK во фракциях и опреде- .4О лении уровня мечения H -триоксаленом в тех же фракциях..

Недостатками этого способа являются невозможность получения количественных показателей перехода моноаддуктов в диаддукты ДНК в динамике этого процесса, а также невозможность определения количества моно- и диацдуктов ДНК при разных количественных соотношениях веществ фурокумаринового ряда и молекул ДНК, Кроме того, недостатком этого способа является использование llHK, прецварительно меченой радиоактивным изотопом Р, а также использование меченого М -триоксалена.

Ueab изобретения - повышение точности способа путем прямого измерения длины молекул ДНК и количественного подсчета циаддуктов (сшивок) ДНК, а

4 1028719 2 также путем косвенного определения количества моноаддуктов,ПНК и скорости перехода моноаддуктов в диаддукты, упро щение способа путем использования на тивной, немеченной радиоактивными изотопами ДНК и немеченного радиоактивными иэотопами вещества фурокумаринового ряда, в частности немеченного 8-мето. ксипсоралена, Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения моноаддуктов и диаддуктов ДНК, включаюше му выращивание культуры клеток на питательной среде и препаративное выцеление ДНК, установление концентрации ElHK, инкубацию препарата OHK с веществом фуроКумаринового ряда, сепарацию полученного продукта, облучение его ультра- фиолетовыми лучами, денатурацию его физическими и химическими средствами, регистрацию диаддук ов, при инкубации препарата llHK с веществом фурокумаринового ряда в качестве препарата ДНК используют нативную ДНК с последующим облучением ультрафиолетовыми лучами, I для регистрации моно-циаццуктов исполь\ эуют электронную микроскопию, а коли чество моноаддуктов рассчитывают.

На чертеже представлен график зависимости количества диадцуктов от времени облучения.

Пример . Клетки китайского хомячка выращивают на ййтательной сре-. де по общепринятой методике без внесения в среду веществ, меченных радиоактивными изотопами. Препаративным ме тодом выделяют нативную llHK и спек гро фотометрически устанавливают ее концентрацию. Всю исхоцную полученную ДНК инкубируют с веществом фурокумаринового ряда, в частности с 8-метоксипсораленом, не меченным радиоактивными изотопами.

Для этого z раствору нативной ДНК в концентрации 50-250 ьжг/мл добавляют спиртовой раствор 8-метоксипсоралена до конечной концентрации 37 мкг/мл.

Инкубацию проводят в 0,5-2,0 мл буферного раствора следующего состава: 0,1 М Ггjs-NCE, 0,01 И ЭДТА (двунатриевая соль этилдиаминтетрауксусной кислоты) с рН 8,4 (буферЬ), при 4 С t в течение 18-24 ч.

Облучают всю инкубированную с 8метоксипсораленом ДНК ультрафиолетовыми лучами с длинОЙ волны 337 нмр с помощью импульсного лазера ЛГИ 21 при комнатной температуре. Моуность дозы составляет 19,7 мВт/см, время облучения 1 мин.

1028

После облучения LIHK отмывают дважцы путем осаждения ее этиловым спиртом с последующим растворением в буфере 6.

Часть исходного обработанного таким образом препарата ДНК оставляют цля необратимой денатурации и электронномикроскопического анализа.

Остальную часть препарата ДНК сепарируют на восемь отцельных порций 10 обьемом по 100 мил. Кажцую порцию,ПНК облучают повторно длинноволновыми ультрафиолетовыми лучами с длиной волны 337 нм с помощью имц лазера ЛГИ-21 при комнатной температуре разное время, в пределах от 20 до 550 мин.

Часть исходно обработанной ДНК и каждую порцию повторно-облученной OHK по отдельности денатурируют необратимо.

Дпя этого ДНК нагревают при 68 С gg

2 мин в следующем составе: 50 мкл раствора llHK, 10 мкл 30% глиоксаля, lOO мкл 99% формамица.

После ценатурации готовят известным способом препараты для электронной микроскопии. Электронно-микроскопическим методом измеряют длину молекул ДНК и количество сшивок (циаддуктов) в этих молекулах в каждой порции LIHK. Для этого, при просмотре пре- 3О паратов в электронном микроскопе фотографируют молекулы LIHK, которые содержат оцнонитевые участки в области сшивок однонцтевых молекул QHK, соответствующие локализации диаццуктов.

Измерение количества циаддуктов и

35 длины молекул LIHK привецены в таблице.

Рассчитывают среднее количество диаддуктов на длину молекул LIHK, выраженную в килобаэах, и среднюю ско40 рость прироста диацдуктов на 1 килоба. зу за период увеличения времени поворотного облучения в цвух порциях LIHK и вносят эти данные в ту же табпицу. . Полученные данные цлины молекулДНК 45 и количества диацдуктов при разном времени повторного облучения позволяют косвенно определить среднюю скорость перехода моноаддуктов в циаццукты за период увеличения времени повторного облучения в двух порциях ДНК, которая соответствует тангенсу угла наклона примой, проходящей через .точки графика.

Срецняя скорость перехоца моноаддуктов в диаддукты циап кт/килобаза мин, вычисляется по формуле

l)g- Э

3„„= Ьр. 2

719 4 где I>> - средняя скорость перехода моноадцуктов в циаццукты; р » тангенс. угла наклона примой. р - количество диадцуктов на еди» ницу цлины молекул LIHK, зарегистрированное в порции ДНК с большим временем повторно го облучения; р — количество циаццуктов на еци

4 ницу цлины молекул QHK, зарегистрированное в порции QHK с меньшим временем повторного облучения;

- время повторного облучения 2 порции LIHK с более длительным облучением;

-Ь„- время повторного облучения порции QHK с менее цлительным облучением.

В примере конкретного осуществлении способа средняя скорость прироста диац» дуктов на ециницу длины ДНК в цвух порциях повторно обработанной LIHK, вычис ленная по указанной выше формуле; прец ставлена следующими цифровыми данными.

Средняя скорость прироста диацдуктов на 1 килобазу (на 1000 .нуклеотидных

f послецовательностей) за время облучения

0 — 24; 24 — 40; 40 - 80 мин равна 0; за время облучения, мин равна соответ ственно 80 - 176, - 1,167 10 -, 176 2,795 10 ; 220 - 3000,825" 10, 300 - 360 - 0,350 10 — 360 — 544 - 0,179:10 .

Вычисляют количество моноацдуктов, возникающих при первичном облучении ис. хоцного продукта gHK косвенным методом.

В трм случае, когца после облучения длинноволновыми ультрафиолетовыми лу чами вешество фурокумаринового ряда удаляют из срецы, содержащей ДНК, диац цукты при повторном облучении длинноволновыми ультрафиолетовыми лучами возникают только из первично индуцированных моноацдуктов ДНК. В порциях повторно обработанной gHK при увеличении времени облучения длинноволновыми ультрафиолетовыми лучами количество первоначально возникших моноаццуктов уменьшается за счет образования циаццуктов. При этом возникает такая ситуация, при которой количество диацдуктов в некоторых пор» циях LIHK в расчете на единицу цлины молекул LIHK не возрастает, несмотря на увеличение времени облучения цлинноволновыми ультрафиолетовыми лучами. Это свицетельствует о том, -что все моноаддукты, способные образовать циаццукты, 1028719

Время облучения, мин:- О

24 40 80 176

544

300 360

220

Количество циацдуктов О

0 О О 18

33 84

34 длина ДНК, кило база

102,2 128 98,6 98,6 160 5 148,7 109,7 260,6

Срецнее коли честно диац ауктое на 1 килобазу

О 0 О О 0,1 12 . 0,235 0,301 0,322

0,289

Средняя ско рость прирос та диаддуктов на 1 кило О

-Ъ . -3 -Ъ -3 . -Ъ

0 О О 1167 10 .2,795 10 0,825 100,350 100 179<10

Составитель А. Макаров

Редактор Н. Воловик Техред М.Костик: Корректор О, Билак

Заказ 4895/24 Тираж 52 Подписное, ВНИИПИ Госуцарстщанвэо комитета СССР по целам изобретений и открытий

113035,Москва, Ж-35, Раушская наб., g. 4/5

Филиал ППП "Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4

5 трансформировались в диаддукты, что дает воэможность косвенно определить ко. личество моноаццуктов, всэникших после первичного облучения, по формуле жан- >min 5 мk гце Q » «количество моноаддуктов на единицу длины ДНК;

g - количество циацдуктов на еди

z длины gHK z сепаpиро ванных *порциях jlHK, в кото рых все моноаддукты, способ ные перейти в днадцукты, трансформировались в диацдуктьц 15

,3) ",;„-. количество циаддуктов на единицу длины ДНК в ис Ю

6 ходном препарате,оНК после первичной обработки;

- эмпирический коэффициент, выражающий долю моноад.» дуктов, способных перехоцить в циадцукты.

В примере конкретного осуществления способа длину молекул llHK измеряют в килобазах: 1 килобаза равна 1000 нуклвотицных пар.

В примере конкретного осушаствлении способа в соответствии с полученными даннымиЭ„;о 0,322 диацдукта-.килоба за фр ди" О днаццуктов/килоб&зщ,)("0,6, Исходя из этого, М(моноаццукты)

О 322-0 0 0;Изт иоиоадцукт/кипойща.