Способ получения @ -лимфоцитов

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU(II) 3(50 G 01 N 33/48

1 I

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТНЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTHA (21) 3310164/28-13 (22) 03.08.81 (46) 30.10.83. Бюл. h 40 (72) Е.Н. Сологуб, В. М. Лубэ, Л.П. Сизякина и Е.Н. Москаленко (71) Ростовский ордена Дружбы народов медицинский институт (53) 621.42(088.8) (S6) 1. Авторское свидетельство СССР

И 787994, кл. G 01 и 33/48, 1980

2, Авторское свидетельство СССР

ll 787995, кл. G 01 N 33/48, 1980.

3. Векслер Х.М., Сочнее А.М., Попов 0;В. Сравнительное излучение методов получения фракций лимфоцитов периферической крови, обогащенной

Т- и В-лимфоклетками. В кн. "Новые иммунорегулирующие препараты и иммунологические методы". Рига, "Зинатне" 1978, с. 39-44 (прототип).. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Т-ЛИМФОЦИТОВ с помощью хроматографии на колонке с нитроном, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения чистоты целевого продукта, перед хроматографией на смесь лимфоцитов действуют ультразвуком с частотой 62-67 кгц интенсивностью 0,12-0,14 Вт/см дли2 тельностью 50-70 с.

1 105

Изобретение относится к медицине, преимущественно иммунологии, и может быть использовано а лабораторной практике для получения чистой популяции

Т-лимфоциток и исследования их функциональных свойств в целях диагностики ряда иммунопатологических состоянии а

Известен способ дифференцирования

Т- и В-лимфоцитов человека путем об- 1о работки их стимулятором розектооЬразования с эритроцитами барана или эритроцитами мыши и оценкой резуль татов реакции (lj и (21 .

Однако эти способы требуют дорогих и дефицитных реактивов для своего воспроизводства.

Известен способ получения Т-лимфоцитов путем выделения из смеси Ти В-лимфоцитов с помощью хроматографии на колонне с нитроном (3) .

Недостатком способа является низкая чистота целевого продукта загрязнение его В-лимфоцитами.

Цель изобретения - повышение чис- 25 тоты целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что в способе получения Т-лимфоцитов путем выделения их из смеси T- u

В-лимфоцитов с помощью хроматографии зо на колонке с нитроном, перед хроматографией на смесь лимфоцитов действуют ультразвуком с частотой 62-67 кГц интенсивностью 0,12»0,14 Вт/см2 длительностью 50-70 с .

Способ осуществляют следующим об35 разом.

В силиконированную пробирку к гепаринизированной донорской крови добавляют раствор декстрана молекулярным

40 слоем 250 тыс.) . После 20 мин экспозиции надосадочную жидкость отсасывают, добавляют среду l99 и центрифугируют при 1 000 об/мин. Супернатант сливают, а к осадку приливают 0,2 мл дистилли45 рованной воды. Затем добавляют 2,0 мл среды 199 и отмывают дважды при

1 000 об/мин в течение 7 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, осадок осторожно встряхивают и к нему пипеткой приливают 0,4 мл среды 199. Эту пробирку со азвесью димфоцитов помещают в сосуд с водой объемом до

0,5 л, в который опускают волновод ультразвукового генератора. Воздействие ультразвуком проводят при частоте 62-67 кГц, интенсивности, 0,120,1 Вт/см, в течение 50-70 с. После обработки ультразвуком колонку, за1427 полненную волокном нитроном для агой цели используют шприц на 5 ил, который на 2-3 мл заполнен ни роном, предварительно активированным 0,2 N соляной кислотой и промытым теплой средой 199 непосредственно перед использованием) заливают 1,0 мл взвеси лимфоцитов, обработанной ультразвуком, инкубируют 45 мин при 37 C . .Пропусо канием через шприц 10,0-15,0 мл теплой среды 199 медленной струей получают в промывной суспензии чистую популяцию T-лимфоцитов, П р и и е р 1. В силиконированную пробирку с 0,4 мл гепаринизированной крови приливают 0,4 мл 44-ного раствора декстрана для получения взвеси лейкоцитов. Надосадочную жидкость отсасывают, центрифугируют при

1 000 об/мин а течение 7 мин, добавляют к осадку 0,2 мл дистиллированHopI воды и пипетируют 15 с. Затем вновь отмывают средой 199 центрифугированием при 1000 об/мин в течение мин, и взвешивают. осадок в 0,4 мл среды 199 для получения концен1рации клеток в пределах 2,0-2,5XIО кл/мл, 6

Полученную клеточную взвесь в пробирке опускают в сосуд с водой вместе с волноводом ультразвукового генератора и подвергают действию ультразвука частотой 65 кГц, интенсивностью

0,12 Вт/см", длительностью 60 с.

Сразу поспе воздействия ультразвуком пропускают взвесь лейксцитов через колонку, заполненную нитроном, предварительно активированным 0,2 N соляной кислотой и промытым теплой средой 199 перед использованием. Заполненную колонку помещают в терностат на 30 мин при 37 С. После инкубации через колонку пропускают

15,0 мл теплой среды 199 медленной струей, таким оЬразом вымывая неприлипшую фракцию Т-лимфоцитов.

Промывную суспензию центрифугируют при 1 000 об/мин в течение 7 мин, осадок взвешивают в.среде 199, доводя концентрацию полученной взвеси до

2,0-2,5410 кл/мл. В две маленькие силиконированные пробирки разливают по 0,2 мл полученной взвеси и приливают по 0,2 мл нативных эритроцитов барана (для Т-лимфоцитов) и эритроцитов мыши в другую пробирку (для

В-лимфоцитов). Проводят реакцию

Т-розеткообразования, после чего обобразовавшиеся розетки фиксируют раствором Зь-ного глутаральдегида, 1051421

Составитель Е . Житникова

Редактор Е. Лушникова Техред. M.Tenep коРРектоР О. Тигор

Тираж 873 Под писное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 8656/43

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 от мы вают дистиллированной водой цен трифугированием при 1 000 об/мин, полученный осадок переносят на предметное стекло. Мазок фиксируют, окрашивают по Браше с подсчетом образовавшихся розеток на 100"200 лимфоцитов.

Также с полученной суспензией

T-aw oil os проводят реакцию В-розеткообраэования, фиксируют образо-. вавшиеся розетки раствором глута- !О ральде гида, отмывают дистиллированной водой, полученный осадок переносят на предметное стекло, мазок фиксируют, окрашивают по Браше и производят под- счет образовавшихся розеток на 100200 лимфоцитов.

До воздействия ультразвука количество В-клеток во фракции T-лимфоцитов было 90 при абсолютном количестве клеток, равном 1030, после воздействия ультразвука примесь В-кле>ток во фракции Т-лифоцитов отсутствовала.

Предлагаемый способ технически прост, позволяет получит ь очищенную популяцию Т-лимфоцитов и может найти применение в экспериментальной медицине, в лабораторной практике при исследовании функциональных свойств

Т-лифоцитов в целях диагностики ряда иммунологических состояний.