Способ сохранения иммунокомпетентных клеток

 

СПОСОБ СОХРАНЕНИЯ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК путем культивирования их в питательной среде, о т личающийся тем, что, с целью повышения срока сохранения функциональной активности иммунокомпетентных клеток, в предварительно охлажденную до питательную среду вводят 10%-ныЙ раствор желатина и культивирование проводят при постепенном понижении температуры с периодическим переме1Ш1ванием , а хранение осуществляют при температуре от О до 4с. СО

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

3ЮС12Ы

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

Г О ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3555203/28-13 (22) 03. 03. 83 (46) 15.02.84. Бюл. 9 б (72) О.Ф.Сенюк (71) Киевский научно-исследовательский институт урологии и нефрологии (53) 615.375(088.8) (56) 1. DonaOdson stephen L;, N1tOer Geenn А, Rice, Patriciа Ь., Ranney Richard, Tew Уонип G., The maintenance of В-сеИ and

Т-ссеИ function in frozen and stored

human.Rymphocytes †. "J.CC1n Immunon." 1981, 1 Р 2 р.106-112.

2. Hofman Ftorens M., Kanssberg

Barbara Smith Diane, Garrison

DougOas, Sevier, 0аРе Stability of . T-апй В-сеИ nurubers in human рег1рЬегаО bOood. -. "Anur.J,, COin.Patho(", 1982, 77, Р б, р.710713.,.Я0„„10732 1 (54) (57) СПОСОБ СОХРАНЕНИЯ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК путем культивирования их в питательной среде, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения срока сохранения функциональной активности иммунокомпетентных клеток, в предвари". тельно охлажденную до .5-15 С питательную среду вводят 10%-ный раствор желатина и культивирование проводят при постепенном понижении температуры с периодическим перемешиванием, а хранение осуществляют при температуре от 0 до 4 С.

1073281

Известен также способ сохранения иммунокомпетентных клеток путем культивирования их в питательной среде МсСоу. 5а с глутамином и антибиотиками (2$.

Однако такой способ ведет к нарушению функциональных характеристик иммунокомпетентных клеток, кро" ме того, срок сохранения их ограничен (до 3 сут.) .

Целью изобретения является повышение срока сохранения функциональ" ной активности иммунокомпетентных клеток.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу сохранения иммунокомпетентных клеток путем культивирования их в питательной среде, в предварительно охлажденную до

5-15 С питательную среду вводят хоа-ный раствор желатина и культивирование проводят при постепенном понижении температуры с периодическим перемешиванием, а хранение осуществ- 35 ляют при 0-4 С.

Способ осуществляют следующим образом.

Гепаринизированную периферическую кровь.(25 E/1 мл гепарина Спо- 40 фа ), разведенную в среде 199 в соотношении 1:3, или гомогенат тканей органов, например селезенки или трансплантированной почки, наслаивают на стандартный градиент 45 плотности фиколл-верографина (1,077-1,078).Выделение иммунокомпетентных клеток производят при

400 д 30 мнн. Выделенные иммунокомпетентные клетки трижды отмывают от фиколла и верографина средой

199 при следующем режиме центрифугирования: 100 д на протяжении

10-15 мин. Затем полученные лимфоциты помещают в стеклянные емкости с предварительно охлажденной до 55

5-15ОС питательной средой 199, до" полнительно содержащей желербразую- . щие компоненты (фабричный 10%-ный раствор желатины, фиксирующие при понижении температуры (до 0-4 "С) имму- 60 нокомпетентные клетки во взвешенно-разделенном состоянии и поддерживающие их в жизнеспособном состоянии, а также инактивированную сыворотку 1 группы кРови человека, 5

Изобретение относится к медицине, . в частности к способам консервации нммунокомпетентных клеток. Известен способ сохранения культуры лимфоцитов, заключающийся в том, что лимфоциты периферической 5 крови замораживают и хранят при (-170)ОС в течение 3-6 нед. Г1).

Однако известный способ требует дсрогостоящей аппаратуры с программным замораживанием и оттаива- 10 нием.

1В-ный раствор 1-глутамина и 2В-ный раствор 1-аспарагина при следующем соотношении компонентов, мас.гг

0,05-0,5

Среда 199, 0,01-0,8

Инактивированная сыворотка 1 группы крови человека

108-ный раствор желатина 0,1"1,0

10-кратная среда 199 0,01-0,1

1В-ный раствор

1-глутамина 0,001-0,008

2%"ный раствор

1-аспарагина 0,001-0,008

При этом сохранение иммунокомпетентных клеток в культуральной среде производят при 0-4 С.

Концентрация клеток доводится до

1-2.10О клеток на 1 мл питательной среды.

Емкости с культуральной средой и клетками ставят в бытовой холодильник и время от времени периодически встряхивают до момента перехода культуральной среды из жидкого состояния в желеобразное с последующим визуальным контролем равномерного распределения клеток °

Если помещенные в емкости клетки за время застывания культуральной среды и перехода ее в состояние геля успевают преимущественно собраться у дна емкостей, необходимо разогреть содержимое емкостей при температуре, не превышающей 37 С а затем снова охладить до 0-4 С.

Образовавшийся гель с иммунокомпетентными клетками культивируют при

0-,4 С.

При этом иммунокомпетентные клетки получают из одного забора крови и/или органов.

Пример. Предлагаемый способ сохранения иммунокомпетентных клеток испытан на культурах клеток крови больных, проходящих курс гемодалиэного лечения по поводу терминальной почечной недостаточности, а также на культурах крови больных раком мочевого пузыря il ст., клиническая группа lie, и культурах клеток крови практически здоровых лиц. Кроме того, тестировались иммунокомпетентные клетки, выделенные иэ селезенок практически здоровых крыс и из селезенок доноров трупной почки.

Выход клеток после выделения составил во всех случаях 75-908, Проба на жизнеспособность клеток после выделения из периферической гепаринизированной крови выявила высокий выход жизнеспособных клеток.

После сохранения иммунокомпетентных клеток по предлагаемому способу на протяжении различных

1073281 сроков (1-.6 дн) проба также выявила высокий выхЬд;жизнеспособных

° клеток (табл.1).

Количественные характеристики ,иммунокомпетентных клеток (T-и В-лимфоцитов) определялисв в реакции 5 розеткообразования .с эритроцитами баранаг E- u EAC-РОК (табл.2).

Функциональные параметры Т» и

В-лимфоцитов изучались в реакциях бласттрансформации лимфоцитов 30

{РВТЛ) под влиянием митогенных доз ФГА ("МеИсоае En ) и ЛИС (выделенный из Е.со4 штаьик 0,55) .

Учет реакций производился морфоло гинескю(.способом.

Количество сохранившихся иммунокомпетентных клеток, Ф, на протяжении, дн.

Свежевыделенные в стандартном градиенте фиколл верографина лимфоциты, В

75-90

-90

80

Ф

В табл.2 приведены количествен- яммунокомпетентных клеток в процессе ные и качественные характеристики хранения.

Таблица 2

Эритроциты

Свежевыделенные клетки, Ъ

Количество иммунокомпетентных клеток, Ф при хранении, сут

Группа практически здоровых лнц (п15) 48,2415, 7

46,3+9,7

Е-РОК

40,513,8

20,5 1,4 14 814 0

20,1+6,3 52,4+17,0

53 2,0

57,3+3,6

25,5+2,75

21,2+4,1

22,514,5

Группа больных, получающих курс гемодиализного лечения по поводу терминальной почечной недостаточности (n--13) 41,3115,5

38,5+5,8

Е-РОК

34,5+5,2

8%5,0

27,517,5

Е AC-POK

12,545,0

РБТЛ на ФГА

РБТЛ на ЛПС

32ó514å3

11, 318,4

16,3+9 2

Е АС-РОК

РБТЛ на ФГА

РБТЛ на ЛГК

14,2+7,1

31,4ф11, 2

18,147,9

В табл.1 представлены данные выхода иммунокомпонентных клеток, выделенных в стандартном градиенте плотности,фиколл-верографина при различных сроках их хранения.

l !

Таблица 1., 1073281

Продолжение табл. 2

Свежевыделенные клетки, В

Количество иммунокомпетентных клеток, % при хранении, сут

Эритроциты

Группа больных раком мочевого пузыря П ст.

Па клиническая группа (n= ll) 19,3+6,3

20,2+5,8

17,5+8,1

ЕРОК

EAC-.РОК

13 3 5 2

l2,416,1

13,7+8,3

19,3+7,1

9, 315,7

7 4,0

10,8+4,1

РБТЛ на ФГА

14,3+3,5

1917,4

РБТЛ на ЛПС

Составитель Т.Крюкова

Редактор Н.швыдкая Техред О.Неце Корректор A.Èëüèí

Заказ 272/23 Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж"35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Таким образом, способ позволяет, ности клеток в 2 раза при сохранении . повысить срок хранения жизнеспособ- 25 высокой Функциональной активности.