Способ получения культуры клеток эпидермиса человека

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУ КЛЕТОК ЭПИДЕРМИСА ЧЕЛОВЕКА путем Обработки кусочков кожи антибиотиками с последующей дезагрегацией протеолитическим фе{ ментом, отделением эпидермиса и культивированием на подложке в питательной среде, о т .л и ч а .ю. щ и и с я тем, что, с целью повышения выхода жизнеспособных клеток и увеличения времени их переживания в культуре, обработку антибиотиками проводят в присутствии 5-10% бычьей сывсфотки при 4-6°С в течение 6-12 ч, дезагрегацию проводят в 0,1-0,2%-ном буферном растворе коллагеназы или гигтуронидазы, а культивирювание осуществляют в присутствии 2-5% сыворотки крови человека, 2г4 ед./МП витамина А, 1-2 мкг/мл витамина Е, 0,1-0,2 мкг/мп витамина I и 12 мкг/мл питательной среды витамина К. (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСН ИХ

РЕСПУБЛИН

I (19) 41 (11) 3(5I) С 12 N 5 00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТЗЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

К АВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3513909/28-13 (22) 05. 1.0.82 (46) 15 ° 06.84: .Бюл. 9 22 (72) В.К.Гаврилюк, Б.Б.Егоров, М.И.Кузин и В.М.Попов (71) Институт биологической физики

AH СССР (53) 576.72(088.8) (56) 1. Патент CIIIA Р 4254226, кл. 435-97, опублик. 1979.

2. Karasek M. etal. - I.Infestigate Dermatology, 56, 1971, р. 205210 (прототип). (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРЫ

КЛЕТОК ЭПИДЕРМИСА ЧЕЛОВЕКА путем обработки кусочков кожи антибиотиками с последующей дезагрегацией протеолитическим ферментом, отделением эпидермиса и культивированием на подложке в питателъной среде, о т.л и ч а .ю шийся тем, что, с целью повЫшения выхода жизнеспособных клеток и увеличения времени их переживания в кулътуре, обработку антибиотиками проводят в присутствии

5-10% бычьей сыворотки при 4-6 С в течение 6-12 ч, деэагрегацию проводят в 0,1-0,2В-ном буферном растворе коллагеназы или гиалуронидазы, а культивирование осуществляют в присутствии 2-5% сыворотки крови человека, 2-4 ед./мп витамина А, 1-2 мкг/мл витамина Е, О, 1-0,2 мкг/мп витамина

В(и 1-2 мкг/мп питателъной среды I() витамина К. 1097671

Пример 1. Взятые у донора кусочки кожи промывают два раза по

5 мин в 0,02%-, ном стандартном растворе .Версена с Na, ЭДТА и помещают для обеззараживания в раствор следующего состава: раствор Хенкса с добавлением 10% бычьей сыворотки, 10 ед/мп пенициллина, 10 ед/мл стрептомицина, 250 ед/мл нистатина.

Кусочки кожи выдерживают в этом растворе при 4 С в течение 12 ч о 55 (время варьирует в зависимости от возраста донора .и состояния кожи, в данном случае возраст донора

60 лет) . Затем эти кусочки 2 раза промывают в 0,02%-ном стандартном 60 растворе Версена для освобождения от больших концентраций антибиотиков и помещают для дезогрегации в

0,2%-ный раствор коллагенаэы, приго-, товленный на растворе Хенкса. Ку- 65

Изобретение относится к области клеточной биологии, в частности к способам культивирования клеток чело века и животных.

Известен способ культивирования культуры клеток эпидермиса человека путем отмывки кусочков кожи, отделения эпидермиса, дезагрегации ткани с последующим сбором клеток, концентрированием их и культивированием в пластиковых флаконах (1) .

Известен также способ получения культуры клеток эпидермиса человека путем обработки кусочков кожи антибиотиками с последующей дезагрегацией протеолитическим ферментом, от- 15 делением эпидермиса и культивированием на подложке в питательной среде f2) .

Однако известные способы не обеспечивают высокого выхода жизнеспособ;р ных клеток и продолжительного их переживания в питательной среде.

Целью изобретения является повышение выхода жизнеспособных клеток

H увеличение их переживания в куль- 25 туре. .I

Цель достигается тем, что согласно способу получения культуры клеток эпидерйиса человека путем обработки кусочков кожи антибиотиками с последующей дезагрегацией протеолитическим ферментом, отделением эпидермиса и культивированием на подложке в питательной среде, обработку антибиотиками проводят в присутствйи 510% бычьей сыворотки при 4-6 С в течение 6-12 ч, дезагрегацию проводят в 0,1-0,2%-ном буферном растворе коллагеназы или гиалуронидазы, а культивирование осуществляют в присутствии 2-5% сыворотки крови чело- 40 века, 2-4 ед./мл витамина А, 12 мкг/мл витамина Е, О, 1-0,2 мкг/мл витамина В1 и 1-2 мкг/мп питательной среды витамина К. сочки кожи выдерживают в этом растворе при комнатной температуре в течение 6 ч. Отделение эпидермиса от дермы контролируют под бинокулярным микроскопом: последовательно наблюдают отслоение эпидермиса от дермы, рогового слоя от собственно эпидермиса и последующую дезагрегацию его

Отслоившиеся клетки сливают, дерму и роговый слой отбрасывают. Клетки эпидермиса собирают центрифугированием при 500 об/мин в течение 10 мин.

Собранные клетки ресуспендируют в ростовой питательной среде следующего состава: среда Игла, 7% бычьей и

3% человеческой сыворотки, 2 ед/мп витамина А, 1 мкг/мл витамина

Е, 1 мкг/мп витамина К (викасол), 0,2 мкг/мп витамина В1 . Клетки (концентрация 5 ° 10 клеток/мл) за5 севают во флаконы Карреля на ацетатцеллюлозную пленку. Культивирование проводят в атмосфере 95% воздуха и

5% СО, при 35 С и 80% влажности. !

На l5-й день культивирования колонии клеток эпидермиса вырастает в сплошной слой Выход клеток с 1 см подложки 1 10 клеток, т.е. количество клеток увеличивается вдвое. Культура представляет собой сплошной газон из 2-3 слоев шйповидных клеток.

Роста фибробластов (клеток дермы} не обнаружено, как и не обнаружено керанизированных (ороговевших) клеток эпидермиса.

Пример 2. Взятые у донора (возраст 40 лет) кусочки кожи дважды промывают по 5 мин в 0,02%-ном растворе Версена, освобождают от микрофлоры в растворе Хенкса, содержащем

5% бычьей сыворотки, 10 ед/мп пенициллина, 10 ед/мл стрептомицина, 250 ед/мп нистатина при 6 С в течение 6 ч. После обработки антибиотиками кусочки кожи споласкивают 2 раза в 0,02%-ном растворе Версена и помещают для дезагрегации в О. 1%-ный раствор гиалуронидазы на растворе

Хенкса, в котором они находятся при комнатной температуре в течение 6 ч.

Получают суспензию клеток эпидермиса аналогично примеру 1. Культуру клеток выращивают во флаконах Карреля на ацетатцеллюлозной пленке при засеве в концентрации 5 ° 10 клеток/мп в питательной среде следующего состава:среда Иглы, 8% бычьей и 2% человеческой сыворотки, 4 ед/мл витамина

А, 2 мкг/мл витамина Е, 2 мкг/мл витамина К, О, 1 мкг/мл витамина В, в условиях примера 1.

Сплошной газон клеток эпидермиса-обраэуется на 17-й день культивирования. Морфологический контроль показывает, что слой состоит из шиповид1097671

Составитель И.Красильников .Редактор Л.Веселовская Техред A.A÷ Корректор A. Ильин

Заказ 4149/23 Тираж 522 Подписное

BHHHGH Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал НПП "Патент", г. Ужгород, ул.Проектная, 4 ных клеток эпидермиса. Ороговевших клеток и фибробластов не обнаружено.

Выход клеток (1,2-1,5) 106 с единицы поверхности обрабатываемого ку= сочка кожи, срок:сохранения жизнеспособности 40-45 дней, по известному способу — 0,5 ° 10 клеток с 1 см*, при этом полученная культура клеток для пересадки неполностью освобожде1 на от микрофлоры, что загрязняет материал.

Использование изобретения позволя-ет получать клетки эпидермиса в боль- шом количестве в жизнеспособном состоянии в течение длительного времени, так как получаемая культура клеток не содержит посторонней микрофлоры °