Питательная среда для выращивания продуцента @ - @ -амино- @ -капролактамгидролазы

 

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ BbffAВДВАНИЯ ПРОДУЦЕНТА Ь-Л-АМИНО- -КАПРОЛАКТАМГИДРОПАЗЫ , содержащая LамиHo-g-капролактам и неорганические соли - однозамещенный фосфорнокислый калий, сернокислый магний, хлористый марганец, отличающаяся тем, что, с целью повышения ферментативной активности биомассы и удешевления среда, она дополнительно содержит глицерин и кукурузный экстракт при следующем соотношении компонентов , г/л воды: N L-ct-амино-Е-капролактам4 ,5-5,5 Глицерин17-23 Кукурузный экстракт ,5,5-6,5 Однозамещенный фосфорнокислый калий 0,8-1,2 Сернокислый магний

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

3уц С 12 Б 1/16

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

IlO ДЕЛДМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И О ГКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЭОБРЕТЕНИ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

5,5-6 5

0,15-0, 25 (21) 356831 4/28-1 3 (22) 27.01.83 (46) 15.11.84 ° Бюп. У 42 (72) Б.П. Старкувене, А.К.Вайткявичюс, А.-А.Б.Паулюконис, А.А.Дикчювене, И.В.Моркявичене, Г.И.Кикшите и Д.А.Казлаускас (71) ВсесоюзньФ научно-исследовательский институт прикладной энзимологии (53) 577.15(088.8) (56) 1. Заявка Японии 950-53.588, кл. 36(2), опублик. 1975.

2. Заявка Японии Ф 52-56.995, кл. С 12 Р 13/00, опублик. 1977.

3. Патент Великобритании . Р 1 334970, кл. С 2 С, опублик. 1973. (54) (57) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЬРАЩИВАНИЯ ПРОДУЦЕНТА Ь-о AMHHO- -КАНРОЛАКТАИГИДРОЛАЗЫ, содержащая Ь- -ами„SUÄÄ 3 124027 А но-f-rcanpoaazrw и неорганические соли — однозамещенный фосфорнокислый калий, сернокислый магний, хлористый марганец, отличающаяся тем, что, с целью повышения ферментативной активности биомассы и удешевления среды, она дополнительно содержит глицерин и кукурузный экстракт при следующем соотношении компонентов, г/л воды:

L-сЬ"амино-&-капролактам 4,5-5,5

Глицерин 17-23

Кукурузный экстракт.

Одно з амеще нный фосфорнокислый калий 0,8-1,2

Сернокислый магний (7-водный) 0,4-0,6

Хлористый марганец (4-водный) 27 2

1 1:1 240

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению питательных сред для выращивания продуцентов внутриклеточного фермента Ь-с(-амино-f-капролак5 тамгидролазы. Предлагаемая питательная среда может быть использована для 1получения биомассы продуцента аминолактамазы, применяемой для получения L-лизина химико-энзиматическим способом.

Известны питательные среды для выращивания продуцентов аминолактамазы, содержащие DL-саламино-$-капролактам (сокращенно DL-аминолактам), дрожже1вой экстракт, пептон, а также глюко- -.

1зу и солодовый экстракт 51 3 и 52 ).

Включение в состав, этих сред дорогостоящих компонентов — дрожжевого экстракта, пептона, солодового экст- д» ракта препятствует их промышленному и именению.

Для выращивания продуцентов аминолактамазы наиболее широко применяет" ся питательная среда, содержащая, г/л воды . глюкоза. 10, L-аминолактам 50, дрожжевой экстракт 0,5 и неорганические соли вЂ,аммоний азотнокислый 3, калий Фосфорнокислый однозамещеиный 1, магний сернокислый 0,5 и марганец хлористый 0,2 (3 ).

Однако ферментативная активность получаемой на этой среде биомассы сравнительно невысокая, среда содержит дорогостоящие компоненты (дрожже.вой экстракт и L-аминокапролактам в большой концентрации), а также компонент, имеющий пищевую ценность (глюкоза).

Цель изобретения — повышение ферментативной ктивности биомассы и

40 удешевление среды.

Поставленная цель достигается тем, что питательная среда для выращивания продуцента Ь-Ы-амино- -капролактамгидролазы, содержащая L-oL-амино-Я-кап45 ролактам и неорганические соли — однозамещенный Фосфорнокислый калий, оернокислый магний, хлористьй марга-, нец, дополнительно содержит глицерин и кукурузный экстракт при .следующем соотношении компонентов, г/л воды:

L-с -амино-Я-капролактам 4-6

Ггпщерин 17-23

Кукурузный экстракт 5,5-6 5

Однозамещенный

Фосфорнокислый кальФ О, 8-1,2

Сернокислый магний (7-водный) 0,4-0,6

Хлористый марганец (4-водный) 0,15-0,25

Сущность изобретения заключается в том, что глицерин и кукурузный экстракт в предлагаемой среде, являясь источником питания, одновременно необходимы для другого назначения— экономического и эффективного получения Ь-с(-. амико-Я-капролактамгидролазы в клетках дрожжей, т.е. их использование приводит к исключению нежелательного явления катаболитной репрессии, значительного уменьшения количества индуктора биосинтеза и увеличению скорости образования Фермента.

Глицерин, .будучи эквивалентным глюкозе как источник углерода, одновременно исключает влияние на биосинтез L-d-амино-Я-капролактамгидролазы нежелательного явления катаболитной репрессии и тем самым позволяет значительно уменьшить концентрацию 1.—

-аминокапролактама в среде, не понижая

Ферментативной активности биомассы.

Таким образом, глицерин, проявляя свойства как источник питания., в случае культивирования продуцента индуци-» бельного фермента L-Х-амино-Е-кап-:— ролактамгидролазы существенно изменяет состав компонентов среды с созданием положительного результата..Кукурузный экстракт но своей питательной ценности можно. считать эквивалентным дрожжевому экстракту. Однако они существенно различаются по влиянию на удельную скорость образования L- 4-амико-с-капролактамгидролазы в клетках. При выращивании Cryptococcus sp. 59 на среде с глицерином, аминокапролактамом, фосфатами и микроэлементами с содержанием дрожжевого или кукурузного экстракта по

0,47., удельная скорость роста в экспоненциальной фазе 0 40 и 0,35 ч 1 соответственно, а удельная скорость

-1 образования целевого фермента 0,08 ч в случае дрожжевого экстракта и

0,3З ч "в случае кукурузного экстракта. Значительное (около 4 раза) увеличение удельной скорости биосинтеза при практически одинаковой скорости роста является отличительным признаком кукурузного экстракта при выращивании продуцента Ь-с -амино-Я-капролактамгидролазы, приводящим к сверхсуммарному результату — повышению ферментативной активности продуцента

3 1124 более. чем в 2 раза. Такой эффект кукурузного экстракта объясняется отсутствием в нем репрессирующнх био-. синтез соединений, например L-лизина, действующего, вероятно, по механизму репрессии.продуктом метаболизма.

Для получения питательной среды л компоненты (кроме фосфорнокислого калия= растворяют в воде, прибавляют 1О

10Х-ный раствор Na0H до 7,0 и стерилизуют 30 мин при 120 С. Раствор фосфорнокислого калия готовят и стерилизуют отдельно. На предлагаемой питательной среде целесообразно выращи- 1S вать культуру Cryptococcus species 59, являющуюся цродуцентом аминолактамазы.

Пример 1. Выращивание продуцента аминолактамазы в колбах., щ

Для выращивания продуцента аминолактамазы Cryptococcus cpecies 59 готовят. питательную среду следующего состава, г/л воды:

L-аминолактам 5. 25

Глицерин 20

Кукурузный экстракт 6

КН2Р04 l

МЯЯО,1 7Н О 0,5

МПС12 4820. 02 зо

Доводят рН питательной среды до

7,0 107-ным раствором NaOH и стерилизуют 30 мин при 120 С. Раствор

KHqP0< стерилизуют отдельно и прибавляют в питательную среду перед засевом. Питательную среду разливают в качалочные колбы"емкостью 750 мл, объем среды в колбе 100 мл.

Культуру.Cryptococcus species 59 обновляют, выращивая в чашках Петри 40 на агаризованной среде того же состао

sa, s течение 48 ч при 30 ч. Для приготовления посевного материала культуру вносят в качалочную колбу со средой и инкубируют. 14 ч на качалке 45 при частоте 200 об/мин и температуре ÇO C. Полученный посевной. материал .засевают в качалочные колбы со средой, используя 2,4 мг культуры на 100 мл среды. Выращивают на качал-50 ке при частоте 200 об/мин, температуре 30 С в течение 18 ч. Затем биомассу отделяют:центрифугированием м

spa 4500 g промывают дважды водой и лиофилизируют. 55

Для определения аминолактамазной активности микробныхс клеток в смонтированную на магнитной мешалке и

027 4 термостатируемую при 50 С ячейку прн" ливают 3 мл 0,1 М раствора L-аминолактама (рН 8,0) при 50 С и вносят точно взвешенное количество (3-5 мг в зависимости от активности) лиофилизованных клеток продуцента. Смесь перемешивают несколько минут, после чего берут контрольную пробу объемом

0,01 мл для определения фоновой концентрации продукта реакции гидролиза аминолактама — лизина. После взятия контрольной пробы смесь перемешивают ровно 30 мин. Реакцию останавливают прибавлением 0 5 мл 2,5 н. НС1. Затем из реакционной смеси берут 3 пробы по 0,01 мл, наносят на хроматографическую бумагу и определяют содержание лизина спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность. окрашенного продукта реакции лизина с фурфуролом по методу N.Patthy, А.Patthy.

Активность аминолактамазы рассчитывают по формуле йЭ ° V - 1000

А — ††-, мкмоль продукта/мин

Е Лй на 1 г клеток, где Ь — разность оптической плотности исследуемой и контрольной проб;

V — объем реакционной смеси в ячейке (после остановки реакции), мл;

E — молярньл< коэффициент экстинкции

Dt — время реакции, мнн; сухой вес клеток, содержащихся в реакционной ячейке, г.

Для определения активности исследуемой партии клеток ставят параллельНо три реакции ферментативного гидролиза аминолактама и рассчитывают среднее арифметическое.

Пример 2. Выращивание продуцента аминолактамазы в дзерментере.

Используют лабораторный ферментер типа "Биолафйтт" емкостью 20 л. Подготовку. питательной среды, обновление культуры и приготовление посевного материала проводят аналогично как в примере 1.

Посевной материал засевают в ферментер, используя 0,5 г культуры на

10 л среды. Выращивают при перемешивании 350 об/мин, температуре ЗООС, аэрации 8-10 л/мин, в течение 18 ч.

Биомассу охлаждают до +4 С, отделяют о

1124027

Таблица 1

Способ выращивания Количество опытов Ферментативная активность, мкмоль/мин, г

Выход биомассы, г/л

В колбах

В ферментере

712+ 64

730+ 58

2,5+ 0,4

5,0+ 0,5

Та блица 2

Питательная среда

Показатели

Прототип (в колбах) Предлагаемая колбах в ферментере

Стоимость компонентов питательной среды (кроме воды), руб/м

1064

152

152

Удельная ферментативная активность биомассы, мкмоль/мин,г

730

32 0

712

Составитель Ф.Кононков

Техред С.Мигунова Корректор Г.Решетник

Редактор M. Дылын

Заказ 8208/24 Тираж 521 ° Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП "Патент", r.Óæãoðîä, ул.Проектная, 4

S центрифигурированием при 4500 g, про мывают дважды водой и лиофилизируют.

В табл. 1 приведены результаты выращивания продуцента аминолактама5

Основные технико-экономические показатели питательных сред для вьгКак следует из приведенных данных, предлагаемая питательная среда по сравнению с прототипом дешевле в

7 раз, удельная ферментативная актив-40 ность биомассы возрастает в 2,2 раза, кроме того, не используются компоненты, имеющие пищевую ценность, что зы Cryptococcus species 59 (доверительный интервал с доверительной вероятностью 0,95) в колбах и в ферме н тере. ращивания аминолактамазы представлены в табл. 2. особенно важно при промышленном применении.

При годовом объеме ферментаций аминолактамазы в 500 м экономический эффект составит 456 тыс. руб. за счет снижения расходов на питательную среду.