Штамм плесневого гриба @ @ f-154-продуцент гуанилрибонуклеазы

 

Штамм плесневого гриба. Аврегgi ttuB сtavatus F-154(Коллекция Центрального музея промышленных микроорганизмов института ВНИИГенетика , коллекционный номер ЩЯШ Г-154)-продуцент гуанилрибонуклеазы.

СООЗ СОВЕТСКИХ

NUN

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

f)0 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕКИЙ М ОУНРЫТИЙ (21) 3613767/28-13 (22) 30.06.83 (46) 30.11.84. Бюл. У 44 (72) С.И.Безбородова, Л.Н.Лаврова, Г.А.Тренина, 3. А.Виестуре, Л.А.Орна н В.Э.Шкинке (7l) Научно-.производственное объединение "Биохимреактив" и Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (53) 577.)5(08&.8} (56) 1. Биосинтез микроорганизмами нуклеаз и протеаз. И., "Наука", )979, с. 107-123.

2. Безбородова С.И. и др. Способность низших грибов синтезировать внеклеточные РНКазы.-"Микробиология", 1968) 37, 1 ° 10.

3. Авторское свидетельство .СССР

)Р 651027, кл. С 12 )) 15/00, )976 (прототип). SU.„1126599 А

ЗСЮ С 12 N 15/00, С 12 И 9/22, С 12 R 1/66 (54)ШТАИИ НЛЕСНЕВОГО ГРИБА АВРЕКСЕЬMS CLAVATUS Г-154 - ПРОДУЦЕНТ

ГУАНИЛРИБОНУКЛЕАЗЫ. (57) Штамм плесневого гриба. Аврегgit Fus c tavatus Р-154(Коллекция

Центрального музея промышленных микроорганизмов института "ВНИИГенетика", коллекционный номер ЦМПИ

F.- I 541-продуцент гуанилрибонукле азы.

1126599

Изобретение относится- к микробиологической и химической промышленности и представляет собой штамм, который может быть использован для получения фермента гуанилрибонуклеа- 5 зы.

Рибонуклеазы получили широкое применение при расшифровке первичной структуры РНК, удалении РНК из различных препаратов, получении 1О олигонуклеотидов и нуклеотидов из

PHK. Ведутся исследования по ферментному синтезу олигонуклеотидов с заданной последовательностью звеньев при помощи рибонуклеаз и по использо-15 ванию РНКаз для лечения ряда вирусных и опухолевых заболеваний. Рибонуклеазы являются также удобными моделями для изучения зависимости между структурой и функцией ферментов.

В качестве основных продуцентов гуанилрибонуклеаэы используются грибы родов Aspergiffus, Fusarium, 25

Penici11ium, Menrospora и др. Я .

Гриб Aspergiffus cfavatus выделяет в питательную среду гуанилспецифичесКую рибонуклеазу. Однако продуктивность культуры низкая: до 30 ед/мл при определении активности по модифизированному методу Анфинсена и др. или 6270 ед/мл при определении активности по методу фирмы Morthingtom (2).

Наиболее близким по технической сущности и достигаемои цели к пред35 лагаемому штамму является актиномицет Actinomyces aureovertici ffatus активно синтезирующий гуанилрибонуклеазу (3) с активностью 25-30 тыс. ед/мл, определенной по методу

Татарской P.È. и др., и длительностью хранения без пересева 1 -2 мес.

Недостатком этой культуры является значительная нестабильность, что заставляет для сохранения активности проводить непрерывную селекцию.

Это недопустимо удорожает производство гуанилрибонуклеазы и не гарантирует стабильности свойств получаемого продукта.

Целью изобретения является получение нового штамма, обладающего повышенной продуктивностью гуанилспецифической рибонуклеазы и стабильностью.":

Поставленная цель достигается тем, что в качестве продуцента гуанилрибонуклеазы используют штамм

Aspergi f fus cfavatus F-154: Штамм

AspergifEus clavatus F-154 депонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов института "ВНИИгенетика" под номером ЦМПМ F-154.

Штамм образует гуанилспецифичес- кую рибонуклеаэу. Культуру выращивают на питательной среде, содержащей соевую муку, пелтон, глюкозу и минеральные соли.

Штамм Aspergiffus c favatus продуцент гуанилрибонуклеазы — получен в результате многократных моноспоровых рассевов культуры с последующим отбором вариантов с высокой продуктивностью гуанилрибонуклеазы.

В отличие от известной культуры, предлагаемый штамм продуцирует гуанилрибонуклеазу в количестве до

60 ед/мл по модифицированному методу

Анфинсена и др. или 12540 ед/мл по методу фирмы worthington и имеет высокую стабильность — сохраняет способность продуцировать гуанилрибонуклеазу при хранения не менее 15 лет без селекционной работы.

Гуанилрибонуклеаэа Aspergi ffus cfavatus эффективна в синтезе тринуклеозид дифосфатов Биоорганическая химия", ! /и

1976, 2, 1111:, 1977, 3, 1475) .

Предлагаемый штамм имеет следующие характеристики..

Морфологические признаки.

Высота конидиеносцев до 1 мм, толщина около 35 мкм, размер вэдутий

140-190 65 мкм, размер головок 400700 мкм, боковых стеригм 7-9 2,5 мкм, верхних 9-1 1 ° 2,5 мкм, конидий—

4-6 на 3,5-4 мкм.

Культуральные признаки.

Штамм растет при 24 С и рН среды

О, 5,7 — 5,9.

При выращивании на твердой среДе

Чапека на третьи сутки роста колонии плоские, голубовато-зеленые, 1,9 см в диаметре с узким белым краем и крупными каплями экссудата. К пятым суткам колония достигает 4 см в диаметре, серединка приподнимается, образуется один спороносный валик, колония становится порошистой, капли экссудата мельче. К 10-м суткам колония 5 см в диаметре, порошистая, темно-сизо-голубоватая с мелкими каплями экссудата.

При выращивании на картофельноморковной среде и .РСА на третьи сутки колонии голубовато- зеленые, I,8 см в диаметре с приподнятой

1126599

3 серединой. Воздушный мицелий развит слабо, крупные капли экссудата. На пятые сутки колонии 3 см в диаметре, серо-голубые с приподнятой серединой и двумя валиками споронос ных эон, на которых расположены капли экссудата; Край колонии паутинистый, голубовато-зеленый. Обратная сторона бесцветная., К 9 — 10-м суткам колония достигает 4,5 см в диаметре, паутинистая, зеленовато-серого цвета, с горками спор по зональному валику.

На картофельно-глюкозовой среде и

РДА на третьи сутки колония 2,5 см в диаметре, голубовато-зеленая, 15 компактная с широким белым краем, приподнятой середгчой. Большие капли . экссудата. К пятым суткам диаметр колонии 4,5 см, цвет. серо-голубой, имеется спороносная середина и два спороносных валика. Край колонии паутинистый, белый. Экссудата нет.

Обратная сторона желтоватая, К 9-19-м суткам диаметр колонии

5 ем, колония резко зональная порошистая, голубовато-серая. Обратная сторона желтоватая. Мелкие капли экссудата.

На солодовой среде на третьи сутки роста диаметр- колонии 1,2 см, цвет голубовато-зеленый, середина

30 приподнята. Скудный воздушный мицелий. Имеется экссудат. На пятые сутки роста диаметр 4 см, колония прижатая, паутинистая с одним спороносным валиком серо-голубого Ç5 цвета. Край колонии паутинистый, серо-зеленый. Редкие капли экссудата, Обратная сторона бесцветная, К 9-1О-м суткам роста диаметр колонии достигает б см, колония поро-4О шистая, голубовато-серая, в центре резко зональная с валиком спор.

Капли экссудата, При глубинном выращивании на среде, содержащей,%: глюкоза 5,0; пептона 1,0; М8$04 7Н О 0,5;

Саср2 2Н20 0,011 КМ09 0,2 при

Э р

24 + !0Ñ мицелий представляет собой бледно-зеленовато-желтую равномерную грибницу, состоящуюиз длинных развет вленных гиф, постепенно переходящих из одной фазы развития в другую.

Физиологические признаки.

Хорошо усваивает сахарозу, глюкозу, хуже маннозу, фруктозу, маннит, 55 глицерин.

Пептонизирует молоко. Разжижает желатину. Гидролиэует крахмал. Обра4 зует внеклеточную гуанил-специфичную РНКазу, гомологичную РНКаэе.

Aspergil Eus orysae пРи выРащивае о нии в колбе при 24+1. С.

Наибольшая активность гуанилрибонуклеаэы в культуральной жидкости имеет место у 3- и 5- суточных культур. Максимальная активность ,внутриклеточного фермента наблюдается у 3- суточных культур.

Суммарная активность культуральной жидкости в 3-10 раз превышает суммарную активность мицелия.

При действии культуральной жидкости на рибонуклеиновую кислоту в качестве продуктов гидролиза обнаружены и:идентифицированы адениловая, гуаниловая, уридиновая и цитидиновая кислоты.

Приготовление питательных сред.

Картофельно-морковная среда, г/л: картофель 20,0; морковь 40,0; агар

+2,0.

Картофельно-глюкозная среда, г/л: картофель 200,0; глюкоза 20,0; агар 2,0.

Солодовая среда, г/л: солодовый экстракт 20,0; агар 2,0.

Пример 1. Культуру Aspergi 0Pus с!аыа иэ F-.154, хранящуюся на скошенном агаре на среде Чапека с сахарозой, выращивают на среде, содержащей, г/л; соевая мука 0,5; глюкоза 5,0; пептон 1,0; Ng$04 7Н О

0,05; СаС 8< беэв. 0,01; KNO> 0,2 (рН до стерилизации 6,2 — 6,3), в течение суток при 24+1 С в колбах емкостью 750 мл ."с объемом указанной среды 100 мл на качалке при 180200 об/мин. Посевной материал в количестве 10% добавляют в среду выше указанного состава и культивируют при тех же условиях ь течение 3 сут.

Активность гаунилрибонуклеазы! определяют при рН 7,8 с использовакием в качестве субстрата дрожжевой

РНК-!1а(НПО "Биохимреактив")и выра-. жают в спектрофотометрических единицах(Е Дв пересчете на 1 мл исследуемой жидкости(Безбородова С.И. и др.

"Микробиология", 1968, 37, 1, 10).

Активность гуанилрибонуклеазы

48,0 ед/мл(9338 ед/мл по методу фирмы VorthingtonI.

Пример 2; Подготовку посевного материала проводят так, как описано в примере 1.

Полученную культуру в количестве

10% используют для засева фермента1) 26599

Составитель И. Привалова

Редактор M.циткина Техред Т.Иаточка. Корректор E. Сирохман

Заказ 8640/20 Тираж 521 . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1 13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул.Проектная, 4 тора — инокулятора(емкость ферментатора 30 л, объем среды 20 л}.

Выращивание инокулюма проводят при 2441 С, при перемешивании

300 об/мин и аэрации 0,6 объема воздуха на 1 объем среды в минуту на среде, указанной в примере 1.

:Через:сутки выросшкйинокулюм s количестве 10Х от объема среды передают в ферментатор емкостью 100 л, содержа: щий 70 л указанной среды. Культиви- . руют 72 ч при 24+1 С, перемешнвании о

300 об/мин. К 72 ч ферментации активность культуральной жидкости составляет но гуаиилрибонуклеазе

60,0 ед/мл.(12546 ед/мл по методу фирмы Worthington) . Затем культураль; ную жидкость обрабатывают известными приемами с последующим выделением гуанилспецифической рибонуклеазы (Безбородова С.И. и др., "Биохимия", 1969, 34, 6, )12 -;) )30).

Испытания штамма Aspergi ffus с tawatus Р 154 в ферментаторах НП6

"Виохимреактив" г. Олайне покаэалй . его высокую продуктивность по.гуа @ ннлспецифической рибонуклеаэе: к 72 ч культивирования штамм продуцирует гуанилрнбонуклеазу с активностью 40 - 60 ед/мл по модифицированному методу Анфинсена и др.(836e- !

2540 ед/мл по методу фирмы Worthington весьма высокую стабнльностЬ (штамм хранился на скошенном агаре без снижения активности 15 лет} .