Способ определения тромбогенных свойств сосудистых протезов

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРОМБОГЕННЫХ СВОЙСТВ СОСУДИСтаХ ПРОТЕЗОВ J путем перфузии исследуемого протеза биологической жидкостью, содержащей тромбоциты, отличающийся тем, что, с целью повышени точности. способа,одновременно с исследуемым протезом перфузируют нативный и деэндотелизированный сосуды плазмой с заданным количеством тромбоцитов, затем подсчитывают число тромбоцитов г в агрегатах на поверхности сосудов и определяют тромбогенные Т свойства , %: Т - Т; X 100, Т Т , - т, где Т, - число тромбоцитов в агрегатах на 1 мм исследуемого протеза; 1„- число тромбоцитов в агрегатах на 1 мм нативного сосуда; число тромбоцитов в агрега (Л тах на I мм деэндотелизированного сосуда.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН ((9) (! 1!

4(5! !

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21 ) 3451941 /28-13 (22) 10.06.82 (46) 30.04. 85.Бюл. № 16 (72) В.В.Долгов, О.Э.Зайкина, В.С.Репин и В.Н.Смирнов (71) Всесоюзный кардиологический научный центр АИ11 СССР и Центральный ордена Ленина институт усовершенствования врачей (53) 616-005.6:616.13-616.14(088.8) (56) 1.. Rajah,S.11. et а11. Tromb.

Res., 1978, ¹ 12, с.141-152. (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРОГ1БОГЕННЫХ СВОЙСТВ СОСУДИСТЫХ ПРОТЕЗОВ ,путем перфузии исследуемого протеза биологической жидкостью, содержащей тромбоциты, отличающийся тем, что, с целью повышени точности, способа, одновременно с исследуемым протезом перфузируют нативный и деэндотелизированный сосуды плазмой с заданным количеством тромбоцитов, затем подсчитывают число тромбоцитов -. в агрегатах на поверхности сосудов и определяют тромбогенные Т свойства, 7.:

Т т, — т х 100, т,-т, где T! — число тромбоцитов в агрегатах на 1 мм исследуемого протеза;

Т вЂ” число тромбоцитов в агрега2 g тах на 1 мм нативного сосуда;

Т вЂ” число тромбоцитов в агрега3 C тах на I мм деэндотелизированного сосуда. С.

1153293

Изобретение относится к медицине, в частности хирургии, и может быть использовано при отборе новых материалов для сосудистых протезов и клапанов сердца. 5

Протезы из синтетических материалов, аллогенные и аутorer иые сосуды используют для пластики артерий среднего и малого диаметра.

Наиболее частым послеоперационным 10 осложнением в ранний период является окклюзия просвета тромба, в поздние сроки окклюзия возникает в результате гиперилазии неоинтимы и вторичного тромбообразования. Указанные осложнения связаны с адгези«й тромбоцитов на поверхности протеза, активацией тромбоцитов с освобождением тромбоцитарных факторов и формированием агрегатов. Поэтому необходимо 20 определение тромбогеииых показателей протезов.

Известен способ оценки тромбогеиных свойств сосудистых протезов ири искусственной перфузии их геиарииизированной кровью (!) .

Согласно этому способу используют две параллельные системы циркуляции (опытную и контрольную), изготовленные из силиконовой резины.

В опытную систему встраивают протезы длиной 15 см. Под давлением 90120 мм рт.ст. протез и контрольную систему перфузируют гепаринизироваи- . ной кровью человека в режиме рецирку35 ляции в течение 60 .мин при 37 С.

Поскольку в данном способе используют гепаринизированную кровь, то до перфузии и несколько раз в течение перфуэии контролируют кровь на лока40 затели свертывания: фибриноген, гемоглобин, гематокрит, количество тромбоцитов, гепарин, адгеэию и агрегацию тромбоцитов. Контрольная система необходима для оценки влияния поверхности соединительных шлан45 гов на коагуляционные свойства крови в системе циркуляции. 1ромбогенные свойства протезов определяют по уменьшению количества тромбоцитов в перфузате через 15, 30 и 60 мин пер- 0 фуэии и качественно оценивают с помощью растровой электронной микроскопии по наличию тромбоцитов (особенно агрегатов) на поверхности протезов.

Недостатком способа является отсутствие колич«ственных критс-риев тромбогеинос ги поверхности сосудистых имплаHTатов. Кроме того, отсутствие анализа стадий адгезии и агрегации тромбоцитов на поверхности протезов Hp. дает возможности сделать длительный послеоперационный прогноз.

Цель изобретения — повышение точности способа.

Поставленная цель достигается тем, что иерфузируют цитратной плазмой с тромбоцитами одновременно с исследуемыми протезами нативную и деэндотелизированную иупочную вену, а затем с помощью растровой элекгронной микроскопии подсчитьизают общее число тромбоцитов и число тромбоцитов в агрегатах на поверхности образцов и определяют тромбогеиные Т свойства,Е:

Т =,, — х 100

Т< — Т

Т вЂ” Т

2 где Т вЂ” число тромбоцитов в агре< гатях на 1 мм исследуемого протеза;

Т вЂ” число тромбоцитов в агрегатах на 1 мм нативиой иуиочной вены;

Т вЂ” число тромбоцитов н агре 1 гатах на мм деэндотелизированиой пупочной вены.

Для определения адгезивных и тром богенных свойств протезов получали перфузат, подготавливали для перфу— эии иативную пупочиую вену, получали сегмент деэндотелизированной пуиочной вены, собирали систему перфузии, включающую все исследуемые протезы и сегменты вен, после перфу— зии фиксировали образцы и из каждого брали пробы для анализа, количественно оценивали адгезивность и тромбогенность протезов.

Для приготовления перфузата у донора брали 100 мл крови, смешивали с антикоагулянтом, состоящим из 0,65 М лимонной кислоты, 0,85 М лимоннокислого натрия и 201 декстрозы; соотношение кровь:антикоагулянт 6:1.

Кровь центрифугировали при 600д в течение 10 мин, Получали супернатант1, представляющий собой плазму, богатую тромбоцитами. Осадок вторично центрифугировали при 4000д в течение 20 мин. Супернатантом-2 разводили супернатант-1 до конечной концентрации 2х!О тромбоцитов в

1 мл. Полученную плазму с тромбоцитами использовали в качестве иерфу1 I 53293

KpllтИ чесKHH 1 Оч Ке. > вс Крыl3ают Вдоль 1 напыляиl э 3 О(3(тОм ОЛОем 30 нм, Ад(езиров..3нные тромбоциты подсчи. тывают с помощью сканирующего элекгронного микроскопа,(Б И-35 в 50200 рандомически Выбранных полях зрения площадью 450 мкм 2при увеличении в 4000 раз.

Адгеэивность протезов 1,А) Вы-. числяют по формуле,7.: г где N — общее число тромбоцитов (2 на 1 мм исследуемого про15 теза;

N — число тромбоцитов на I мм

2 нативной пупочной вены;

N — число тромбоцитов на 1 мм

3 цеэндотелизированной пу20 почной вены.

Тромбогенность протезов (Т) вычисляют по формуле,Е: т = — —.—.*- x ioo, т,-т, где Т вЂ” число тромбоцитов В агрегатах на 1 мм исследуемого

35

40. 1Ополнительным критерием агрегац((и служило процентное содержание агрегатов по 2-5, 6-15 и более 15

45 тромбоц (тов.

После перфузии протезы и сегменты вен промывают 200 мл среды 199 и фиксируют 2, 5Х-íûì глют правым аль- 50 дегидом, приготовленным на растворе

Тираде, в течение 16 ч при давлении

60 мм рт.ст. Затем протезы омывают от фиксатора в течение 20 мин проточной водой, дегидратируют и раство- 55 рах этанола Возрастающей концентрации (40, 60. 80, 90, 96, 100/) и ацеО то((е по 15 мин при 37 С, сушат при.3ат». Дня контра.(я 1(ерфу 3ата и < и(..— тем циркуляции бр((пи 2 мкл перфузат(1 ДО и пас(1(. II&. рфузии и фиксирОВа ли (1 т(чение 2 ч в 8 л(п "-,57.-ного

1 ЛН Г lpa НО(О 11ЛЬД(3 Гида у при l OTO(3l(BH но(о на растворе тираде (рн 7, 3) .

Фиксировали тромбоциты и осажда(ли на фильтры нуклеопоры. Тромбопиты исследовали с помощью растровой электронной микроскопии (12) .

Подгото(зка нативной пупочной вены для перфузии.

Сразу после родов пуповину промывают средой 199. В .стерильном контейнере доставляют в лабораторию и используют для перфузии в течение

30-60 мин. Сохранность эндотелиального покрова нупочной вены контролировали с помощью растрового электронного микроскопа.

Подготовка деэндотелизированной пупочной вены для перфузии.

От нативной пупочной вены отсекают сегмент длиной 5 см. Внутрисосудистым балонным катетером Фогарти диаметром 6 мм, раздутым (IoiI, давлением 400 мм рт.ст., деэндотелизировали nупочную вену. Полноту уд;11(е(3ия эндотелия контролируют с помощью растровой электронной микроскопии.

Пример I. Сегменты протезов, биоимплантант, изготовленный в lI»c.l.« туте сердечно-сосудистой хирургии им.Бакулева, а также сегменты нативной и деэндотелизирован(п и пупочной вены каждый длиной 5 см и диаметром 6 мм последовательно соединяют через канюпи в за(чкнутую цепь и О;1новременно перфузируют В режиме рециркуляции плазмой человека при гидростатическом давлешш 60 мм рт.ст., скорости тока 20 мл /л(ин, тем((ературе 37 С в течение 30 мин. Для соео, динительных шлангов использовали силиконовую резину с внутренним диаметром 5 мм. Обьем перфузата составляет 30 лц(. протеза;

Т2 — число тромбоцитов в агрегатах на 1 мм нативной пу2

ПОЧНОй ВЕНЫ;

Т. — число тромбоцитов в агрега 1

2 гах на 1 мм деэндотелиэированной пупочпой вены.

Для дополнительной характеристики адгезивных свойств протезов апредсляют в процентах количество одиночных тромбоцитов, имеющих форму сферы (первичная стадия контакт.ной активации) и количество распластанных тромбоцитов (вторичная стадия онтактной активации).

В процессе перфузии происходила незначительная активация тромбоцитов в перфуэате. Об этом свидетельствует сни3..:eíHå процентного содержания дискоидных форл(с 54 (до перфузии) до 422 (после перфузии) и увеличение сфер с псевдоподиями с 18 до ЗОБ; количество сфер и дисков с лсевдоподиями не менялось. Число тромбоцитов в перфуэате уменьшалось с 2,0 до 1,8 х 10 мч.

1153293

Агрегаты тромбоцитов из

Тромбогенность (Т,X

Плоти . Tb Контактная активаЛдгезивность(A), 7.

Пуиочная вена ция адгезии на 1 мм

2-5 6 — 15 >15

Первич- Вторичная ная

Натив35 0

1150 ная

Деэндотелизированная

100 7 28 39

90200 12

100

Биоимплантат

0 4 42 14 0

1450

0,3

Со ст авитель 3 . Вальков ская

Редактор M. Кспемеш Техред Л.Микеш Корректор И.Эрдейи

Заказ 2500/38 Тираж 897 Подписное

И1ИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

11 3035, 11осква, Ж-.35, Раушская наб,, д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Количественные характенистики адгезивностп и тромбогенности протезов и

Приведенные данные свидетельствуют, что биоимплантат по адгезивности и тромбогенности близок к нативной пупочной вене ° Тем не менее на биоимплантате происходит увели- 30 чение популяции первично активированных тромбоцитов и появляются агрегаты средних размеров из 6-15 ч ромбоцитов, которые отсутствуют на нативной пупочной вене, 35

Использование предлагаемого способа позволяет проводить количественную оценку адгезивных и тромбонативной идеэндотелизировлнной пчпочцой вены представлены в таблице. генных свойств искусственных протезов по более чувствительным критериям, чем те, которые использовались ранее. Раздельный анализ адгезивности и тромбогепности позволяет делать прогноз с ранних и поздних послеоперационных осложнениях. Предложенный подход может быть использован дпя сравнительного отбора протезов в качестве трансплантатов, а ,также для анализа эффекта препаратов, предупреждающих адгезию и агрегацию тромбоцитов на поверхностях.