Способ определения активности множественных форм щелочной фосфатазы

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ МНОЖЕСТВЕННЫХ ФОРМ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ путем гель-фильтра11Д€и в тонком слое, извлечения полученных фракций, проведения ферментативной реакции с и-нитрофенилфосфатом в качестве субстрата с последующей спектрофотометрией продукта, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа извлечение продукта фермент-субстрат ной реакции проводят 0,05-1,0 н.МаОН

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (l9) (I 1) 4<5» С 01 И 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЦТИЙ (21) 3488713/28-.13 (22) 09.09,82 (46) 30.04.85,Бюл. У 16 (72) Л.Л.Громашевская и И.М.Радзевич (71) Киевский научно-исследовательский институт эпидемиологии, микробиологии, паразитологии и инфекционных болезней им. Л.В.Громашевского (53) 616.07(088.8) (56) ). Dunne Y., Fennelly Y. Ис,Guney K. Cancer, 1967, V.20, р.71 (прототип}. (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ МНОЖЕСТВЕННЫХ ФОРМ ЩЕЛОЧНОЙ

ФОСФАТАЗЫ путем гель-фильтрации в тонком слое, извлечения полученных фракций, проведения ферментативной реакции с и -нитрофенилфосфатом в качестве субстрата с последующей спектрофотометрией продукта, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа извлечение продукта фермент-субстратной реакции проводят 0,05-1 0 í.NaOH

1153294

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для диагностики обтурационных желтух, а также количественного определения форм щелочной фосфатазы, отличающихся молекулярной массой .высокомолекулярных комплексов и свободных молекул, находящихся в смеси.

Известен способ определения активности множественных форм щелочной фосфатазы путем гель-фильтрации через колонку с сефадексом Г-200 с последующим определением активности в большом количестве фракций (lj .

Однако известный способ дает возможность анализировать только один образец, требует большой затраты времени и материала (0,5-1,0 мл сыворотки) и не позволяет проводить серийных исследований.

Цель изобретения — повышение чувствительности способа.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения активности множественных форм щелочной фосфатазы, путем гель †фильтрац в тонком слое, извлечения полученных фракций, проведения ферментативной реакции с и-нитрофенилфосфатом в качестве субстрата с последующей спек30 трофотометрией продукта, извлечение продукта фермент-субстратной реакции проводят 0 05-!,0 н. NaOH, Способ осуществляют следующим образом.

Разделение сывороток или другого исследуемого материала проводится в приборе для тонкослойной гель-фильтрации на стеклянной пластинке

l5x23. см в 0,5 мм слое сефадекса

Г-200 сверхтонкого, уравновешенного 0,025 1! трис-HCE буфером рН 8,0, содержащим 0 15 И МаСС. Угол наклона пластинки 20 . Сыворотки наносят в количестве 0,01-0,02 мл.

Разделение продолжается 5-6 ч. 45

Активность полученных фракций определяют с помощью бумажных реплик (ватман Ф 3) Зх15 см, пропитанных субстратной смесью следующего состава: 0,25 M карбонат-бикарбонатный буфер рН 10,1 10 мм п-нитрофенилфосфата, 5 мм MgCk<, которая равномерно в количестве 1 мл наносится пипеткой на бумажные реплики, помещенные в кювету из оргстекла. Лен- Ы, о ты просушивают в темноте при 7 С и хранят в темноте при комнатной температуре до использования и используют в день приготовления. Эти реплики накладывают на участок пластинки, содержащий разделенные фракции каждой сыворотки, и снимают через 3 мин. Затем их помещают в герметическую кювету из оргстекла и ино кубируют в темноте 30 мин при 37 С.

В результате этого репликах выявляются фракции щелочной фосфатазы в виде ярко-желтых пятен. Дпя количественного определения активности фракций реплики разрезают на части, содержащие окрашенные зоны, и немедленно помещают в пробирки, в которые предварительно вносят 4 мл 0,05l 0 н. раствора NaOH. Образовавшийся в результате реакции и-нитрофенол элюируют !О мин при комнатной температуре и измеряют экстинкцию раствора при 410 нм против 0,1 н.

NaOH соответствующей концентрации.

Аналогичной обработке подвергают контрольную реплику, которую накладывают на часть пластинки, не содержащую сыворотки. После окончанйя энюции измеряют длину бумажных отрезков.Для,расчета активности во фракциях из величины экстинкции элюата фракции вычитают экстинкцию элюата контроля, по площади соответствующую определяемой фракции. Величина экстинкции элюата пропорциональна активности фермента.

Пример I Больная Ш. 59 лет, диагноз — хронический гепатит ° Общая активность щелочной фосфатазы определяли методом Бессей, Лоури и

Брок и она была равна 81,8 мм/л ч„

Разделение сыворотки вели описанным способом. Элюцию вели 0,1 н

NaOH..В результате было установлено, что процентное содержание щелочной фосфатазы в первой фракции составляет 31 6-31,8Х, что соответствует активности 25,8-26,0 мм/л ч, а во второй фракции — 55,8-56,0 мм/

/луч.

Пример 2. Больной Ж. 42 лет диагноз — вирусный гепатит. Общая активность щелочной фосфатазы

10,9 мм/л ч.

Определения ведут как в примере 1

Элюцию проводят 0, 05 н. NaOH. В результате исследования было установлено, что процентное содержание фермента в первой фракции было )4,9 с активностью 1,62 мм/л ч, а во второи

85,17. с активностью 9,28 мм/л ч.

1153294

Составитель И. Емельяненко

Техред Л.Микеш Корреютор И. Эрдейи

Редактор M.Êåëåìåø

Заказ 2500/38 Тираж 897 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Пример 3. Больная Я. 27, лет диагноз — вирусный гепатит. Общая активность щелочной фосфатазы !

2,6 мм/л ч °

Определение щелочной фосфатазы проводили по примеру 1, элюцию производили в 1 í.NaOH. В результате исследования установлено, что процентное содержание щелочной фосфатазы в первой фракции составило

29,9 с активностью 3,78 мм/л ч, а во второй — 70,1X,ñ активностью

8,82 мм/л ° ÷.

Изобретение повышает производительность способа в 50 раз по сравнению с прототипом, за счет чего сокращается объем исследуемой сыворотки с 0 5-1 мп до 0,01-0,02 мп.

Способ прост в исполнении и сокращает время анализа в связи с тем, 10 что определения активности фермент ведут в 2-3 фракциях вместо 30-40 по известному техническому решению.