Способ идентификации ингибиторов протеиназ

 

СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕИНАЗ путем фракционирования белка в гелях, отличающ и и с я тем, что, с целью повышения чувСтвительно(:ти и упрощения способа, на разделяющий гель после фракционирования накладывают лист фильтровальной бумаги, смоченной раствором протеиназы в буфере с рН, оптимальным для используемой протеиназы , и с активностью протеиназы , соответствующей активности трипсина в концентрации 0,0250 ,05 мг/мл, через 10-30 мин бумагу удаляют, на гель накладывают фотопленку типов Фото или Аэропленка и инкубируют до визуального обнаружения на фотопленке полос неразрушенного желатина, снимают фотопленку с геля, накладьшают на нее лист влажной фильтровальной бумаги и идентифицируют ингибиторы по зо . нам неразрушенного желатина в виде i темных полос на прозрачном фоне фотопленки или светлых полос на (Л темном. фоне на фильтровальной бумаге .

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (51)4

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ

Н АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3653896/28-13 (22) 11.10.83 (46) 15.09.85. Бюл. N- 34 (72) В.А. Кокарев (71) Всесоюзный ордена Трудового

Красного Знамени научно-исследовательский институт защиты растений (53) 577.156 (088.8) (56) H1 igaard J. -Anal. Biot hem., 1981, v. 116, М 2, 444 — 449. (54)(57) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕИНАЗ путем фракционирования белка в гелях, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью повышения чувбтвительности и упрощения способа, на разделяющий гель после фракционирования накладывают лист фильтровальной бумаги, смоченной

„„SU„„1178761 раствором протеиназы в буфере с рН, оптимальным для используемой протеиназы, и с активностью протеиназы, соответствующей активности трипсина в концентрации 0,0250,05 мг/мл, через 10-30 мин бумагу удаляют, на гель накладывают фотопленку типов "Фото" или "Аэропленка" и инкубируют до визуального обнаружения на фотопленке полос неразрушенного желатина, снимают фотопленку с геля, накладывают на нее лист влажной фильтровальной бумаги и идентифицируют ингибиторы по зо. нам неразрушенного желатина в виде темных полос на прозрачном фоне фотопленки или светлых полос на темном. фоне на фильтровальной бумаге.

1178761

ВНИИПИ Заказ 5609/22

Тираж 525 Подписное

Филиал ППП "Патент", r. Óæãoðîä, ул.Проектная, 4

Изобретение относится к биохимии растений и может быть использовано также в области генетики, селекции и защиты растений1 биохимии питания и кормления. 5

Цель изобретения — повышение чувствительности и упрощение способа, Пример. Идентификация ингибиторов трипсина среди белков зерна пшеницы.

Зерно пшеницы размалывают, навеску муки заливают 4-кратным объемом

2 М мочевины и выдерживают 18 ч при

4 С. Смесь центрифугируют, осадок отбрасывают. 15

Изофокусирование белков проводят в пластине полиакриламидного геля

125Х250<0,2 мм на приборе типа "Мультифор" фирмы "LKB" (Швеция) или другом приборе для изофокусирования.

Состав геля: 6Х акриламида, 0,28Х метиленбисакриламида, 1Х амфолитов типа "Сервилат" ("Serva ФРГ), мож но также использовать амфолиты других фирм, например "Амфолины" ("? КВ",25

Швеция), с интервалом рН 2-11. Гель полимеризуют на свету после дегазации, добавив к 10 мл раствора геля 0,5 мл раствора рибофлавина (10 мг/100 мл) и 20 мкл ТЕМЕДа. 30

Экстракт белков зерна наносят на гель каплями объемом 0 5-25 мкл на образец. Поскольку ингибиторы трипсина отличаются у разных сортов и Видов пшениц по компонентному составу и активности, объем экстракта нужно подбирать в каждом отдельном случае для того, чтобы получить контрастный спектр ингибиторов. В описываемых условиях следует нано- 40 сить 6-9 мкл экстракта из муки мягкой пшеницы сорта Безостая 1, твердой пшеницы 20-25 мкл, диплоидной одноэернянки 0,5-1,0 мкл. На одной пластине анализируют одновременно

24 образца (1 см на образец) или

48 образцов (по 0,5 см). На гель накладывают электродные полоски, смоченные 1.M NaOEI (-) и 1 М Н,РО (+). Сверху накладывают крышку с 5О платиновыми электродами. Изофокусирование ведут 2,5 ч при постоянной мощности тока 10 В. Конечное напряжение 1800 В. Электродные полоски удаляют вместе с тем участком геля, на котором они лежали. На гель накладывают лист гладкой фильтровальной бумаги, смоченной раствором трипсина (0,03 мг/мл, фирма

"Spota", Чехословакия) в 0,2 М фосфатном буфере рН 8,0. Оптимальный рН трипсина около 8,0-9,0.

Гель накрывают полимерной пленкой для предотвращения высыхания. Через 15 мин бумагу убирают и на гель накладывают фотопленку типа

"Фото-65", предварительно смочив гель фосфатным буфером. Сверху накладывают жесткую полимерную пленку для предотвращения подсыхания и деформации краев фотопленки и выдерживают в термостате 35 мин при 37 С. Под действием фермента, адсорбированного поверхностью геля, желатин разрушается, что можно контролировать по появлению мутной жидкости из-под краев фотопленки. Можно также просматривать гель с пленкой на свету, не наклоняя гель. Момент завершения инкубации определяется по мере появления различных полос — неразрушенными остаются лишь участки слоя желатина, соответствующие ингибиторам данной протеиназы. Фотопленку снимают с геля, накладывают на нее влажную фильтровальную бумагу, которую затем подсушивают листом сухой фильтровальной бумаги. Фотопленку отделяют от бумаги. Зоны, . соответствующие ингибиторам трипсина, обнаруживаются на фотопленке в виде темных полос на прозрачном фоне. Фотопленку подсушивают на воздухе и фотографируют в проходящем свете. Ингибиторы можно также выявить на фильтровальной бумаге, которую накладывали на фотопленку после инкубации. Ингибиторам соответствуют светлые полосы на темном фоне.