Способ удаления нуклеиновых кислот из ферментсодержащих клеточных экстрактов @ @

 

СОЮЗ а:ЕЕТСНИХ

РЕСПУБЛИК (5р 4 С 1 2 Н 9/00, С 07 С 7/02// //С 07 С 7/028 (С !2 Я 9/00, .С.32 и - Я вЂ”вЂ”

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ .

К А STOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

Il0 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3825153/28-13 (22) 17.12.84 (46) 23.05.86. Бюл. В 19 (71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ (72) В. П. Романов, С. Н. Загребельный, В. Ф. Майстренко и Н. М. Пустошилова (53) 577.15.07(088.8) (56) Goulian M., Lucas Ь. J., Kovnberg А. Ensymatic Synthesis of

Deoxyribonucleic Acid, — J.Biol, Chem, 1968, v.243, р.627-638.,.SUÄÄ 1232680 А 1 (54) (57) СПОСОБ УДАЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ

КИСЛОТ ИЗ ФЕРМЕНТСОДЕРЖАЩИХ КЛЕТОЧНЫХ 3KCTPAKTOB ESCHERICHIA СОЫ, включающий воэдействие на них фракционирующнм реагентом, концентрирование недосадочной жидкости сульфатом аммония и обессоливание полученного ферментационного раствора диалиэом, отличающийся тем, что, с целью увеличения содержания фермента в целевом продукте, в качестве фракционирующего реагента нспольэуют раствор триэтилентетрамингндрохлорида рН 7,0-7,5 в количестве, необходимом для доведения концентрации

C последнего в смеси с клеточным фер- ® ментсодераащим экстрактом 0,5-1,0Х. раза буфером, мМ: таис -НСт, 50 (рН 7,0-7,2); 2-меркаптоэтанол 10 (буфер Б). К смеси добавляют фракционирующий реагент — 10 -ный раствор триэтилентетрамингидрохлорида рН 7,0 до конечной концентрации последнего 0,5Х. Суспензию перемешивают

30 мин и осадок удаляют центрифугированием. К надосадочной жидкости добавляют сульфат аммония (55-60Х от насыщения). Образовавшийся осадок собирают центрифугированием и растворяют в буфере, мМ:таис -НС 10 (pH 7,5); ЭДТА 0,2; 2-меркаптоэтанол 1О (буфер В) . Для обессоливания проводят диализ против этого же буфера.

Все процедуры проводят при 0-5 С °

Результаты фракционирования клеточного экстракта при выделении

РНК-лигаэы фага Т4 приведены в табл. 1, П р и и е р 2. 25 r биомассы

Е. coli В, инфицированной фагом

Т4 am Ф 82, суспендируют в 75 мл буфера А. Суспенэию обрабатывают и центрифугируют аналогично примеру 1.

К разбавленной надосадочной,жидкости добавляют 10Х-ный раствор триэтилентетрамингидрохлорида (рН 7,5) до конечной концентрации последнего 1 ..

Суспенэию перемешивают 30 мин и обрабатывают аналогично примеру 1.

Результаты анализов при выделении

ДНК-нолимераэы фага Т4 представлены в табл,. 2.

Пример 3. Все процедуры проводят аналогично примеру 2, используя 50 г биомассы.

Результаты анализов при выделении полинуклеотидкинаэы фага Т4 приведены в табл. 3.

П р и и е р 4. Все процедуры проводят аналогично примеру 1, используя

10 r биомассы, добавляя триэтилентетрамингидрохлорид до конечной концентрации 0,4 .

Результаты анализов при выделении

РНК-лигазы фага Т4 представлены в табл, 4.

Предлагаемый способ позволяет расширить ассортимент фракционирующих реагентов для удаления нуклеиновых кислот и повысить выход ферментов с 60 до 80-100Х.

1 1232680

Изобретение относится к биохимии, а именно к способам получения ферментов из микробиологического сырья.

Источником ферментов часто служат клетки микроорганизмов. Очистка фермента включает в себя несколько стадий: получение клеточного экстракта, грубое фракционирование клеточного экстракта с целью удаления нуклеиновых кислот и очистка фермента хро- 10 матографией.

В связи с этим важнейшей задачей на первых стадиях очистки ферментов является освобождение от нуклеиновых кислот с помощью различных фракцио- 15 нирующих реагентов.

Цель изобретения — увеличение содержания фермента в целевом. продукте.

В предлагаемом способе используют в качестве фракционирующего реагента 20 раствор триэтилентетрамингидрохлорида в экспериментально подобранном оптимальном режиме. Интервалы рН 7,07,5 обусловлены наиболее высокой стабильностью ферментов при данных эна- 25 чениях рН. Кроме того, используемый буферный раствор на основе теис -HCf, и триэтилентетрамин в указанной области имеет максимальную буферную емкость. При добавлении триэтилен- 30 тетрамингидрохлорида до концентрации ниже 0,5 . снижаются выходы ферментов, так как часть их осаждается с нуклеиновыми кислотами. Увеличение концентрации триэтилеитетрамингидрохлорида до концентрации выше l вызывает увеличение расхода реакгива без увеличения выхода ферментов.

Кроме того, избыток реактива затрудняет определение активности ферментов, концентрации белка, а также возникают трудности при дальнейшей очистке ферментов вследствие сорбции катиона триэтилентетрамина на хроматографических колонках. 45

Пример 1. 100 г биомассы клеток Е. coli В, инфицированной фагом Т4 аш Ф 82, суспендируют в

300 мл буферного раствора, мМ: таис -НСь 50 (рН 8,0); ЗДТА 2; 2-мер- ;0 каптоэтанол 10 (буфер А). Суспенэию перемешивают 30 мин и обрабатывают на ультразвуковом дезинтеграторе.

Клеточные обломки осаждают на центрифуге.

"i5

Полученную надосадочную жидкость (клеточный экстракт) разбавляют два

1232680

Таблица l

Активность

Содержание

Процедура

Белок, мг нуклеиновых кислот, Х

8950 530

100 20

Фракционирование триэтилентетрамингидрохлоридом 6120 496

6,5

93

3760 442

117

1,5

Таблица 2

Белок, мг

Активность

Содер)кание

Процедура нуклеиновых кислот

1584 92

100 20

Фракционирование триэтилентетрамингидрохлоридом 700 143

204

155 6,5

113 0,25

689

104

150

Активность выше 100Х относительно клеточного экстракта объясняется наличием в клеточном экстракте нуклеаз, занимающих действительную активность ДНК-полимераэы при ее определении.

Получение клеточного экстракта

Осазкдение сульфатом аммония и обессопиваиие

Получение клеточного экстракта

Осаждение сульфатом аммония и обессоливание общая, уделье.а.х. ная, 10 е.а./м общая, уделье.а ° ная, 10 е.а/мг

Выход фермента, Х

Выхо фермент

Таблица 3 I

Процедура

Активность

Белок, мг

Содержание нуклеиновых кислот, 7

Получение клеточ» ного экстракта

3113 43,2 13,9 100 20

Фракционирование триэтилентетра,мингидрохлоридом 1450 47,0

32,4

107 6,5

1450 40,4 27,9 94

0,25

Таблица 4

Активность

Содер" жание

Процедура елок, г нуклеиновых кислот, Получение клеточного экстракта 438

60,0

26,0

100 20

60,6 60

15,6

6,0

200 15,0 75,0

0,5

Составитель Т. Золотарева

Техред И.Попович Корректор А. Тяско

Редактор Н. Гунько

Заказ 2737/27 Тираж 490

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Осаждение сульфатом аммония и обессоливание

Фракционирование триэтилентетрамингидрохлоридом 282

Осаждение сульфатом аммония и обессоливание общая, е.а.

«10 общая, е.а, «10 удельная, е.a!ìò удельная» е,а/мг

Выход фермента, Х

Выход фермента, Х