Способ определения нарушения иммунного статуса

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

„„SU„„1237215

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСКОМ, б СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (2!) 3695549/28-!4 (22) 01.02.84 (46) !5.06.86. Бюл. У 22 (7!) 1-й Московский ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени медицинский институт им. И.М.Сеченова (72) А.А.Ишиухаметов, В.А.Алешкин и В.Н.Кулаков (53) 615.373(088.8 ) (56) Hudson L., Нау У С. Practical

immunology. — London. 1976

Нау Г.С., Ninebam L. L, Roitt, Rheumatoid arthritis and Immune Соврlexes. — Immune comPlexes. Marburg, 1979, р. 54-62. (51) 4 А 61 К 39/00, С 01 N 33/541 (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАРУШЕНИЯ

ИММУННОГО СТАТУСА путем соединения исследуемой пробы, содержащей иммунные комплексы, с фиксированным на твердой фазе С, компонентом комплемента с последующим иммунорадиометрическим выявлением иммуноглобулинов класса Q в составе комплексов, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с целью повьппения точности способа, дополнительно выявляют с помощью двойных антител иммуноглобулины классов А и М и при увеличении количества одного из классов иммуноглобулинов по сравнению с нормой дпределяют нарушение иммуного статуса .

1 )2372

Изобретение относится к медицине конкретнее к терапии, и может быть использовано для определения нарушения иммунного статуса, назначения адекватного лечения и контроля i за проводимым лечением.

Цель изобретения — повышение точности способа путем выявления с помощью двойных антител одновременно

IgG, IgA u IgN. 1О

Способ осуществляется следующим образом.

Иммунорадиометрическим методом двойных антител в составе комплексов выявляются иммуноглобулины трех классов — А, М и G При этом фиксированный на твердой фазе компонент комплемента взаимодействует с иммунными комплексами с последующим добавлением антител 1-ro порядка с активностью к иммуноглобулинам клас зс сов А, M и С и меченных изотопом I антител 2 † порядка. Наличие иммунных комплексов определяется на основе подсчета процента связавшихся ме- 25 ченых антител 2-ro порядка при использовании антител I-ro порядка к каждому классу иммуноглобулинов — А, М, С. В случае содержания одного иэ классов иммуноглобулинов по сравнению с нормой определяют нарушение иммунного статуса.

Пример !. Больная К., 19 лет. Диагноз: ревматоидный артрит, серопоэитивный вариант, актив35 ность П (ревматоидный миокардит7) .

В течение месяца получала метиндол в дозе до 150 мг/сут в сочетании с плаквенилом. Несмотря на проводимую терапию продолжала предъявлять жалобы на утреннюю скованность до 2 ч, выраженные боли в суставах. Для дальнейшего лечения появилась необходимость в проведении определения нарушения иммунного статуса.

Способ определения нарушения иммунного статуса проводится в,цва этапа.

1 этап ° Необходимые реактивы и их получение.

1) забор, приготовление и хранение пробы осуществляется на основе рекомендаций ВОЗ (3);

2) получение С1ц фракции комплемента из донорской сыворотки;

3) набор кроличьих антисывороток к .иммуноглобулинам классов А, М, и

G человека (производство НИИ вакцин

Таблица 1

Антитела 1-го порядка к иммуноглобулинам класса

Пробирка

) to

0,I

3-4.!

5 2 и сывороток, г. Горький) — антитела

1-го порядка;

4) получение меченых ослиных антител к иммуноглобулинам класса кролика — ан гитела 2-ro порядка: используется ослиная антисыворотка к иммуноглобулинам кролика (производство

Н)ИЭ им. Гамалеи), введение изотопа производится с помощью хлорамина;

5). забуферный физиологический раствор — ЗФР (рН 7,4);

6) желатин медицинский;

7) этилен,циамин тетрауксусная кис. лота — ЭДТА (0,01 M);

8) полистиреновые пробирки;

9) твин 20;

l0) счетчик -излучений.

II этап. Определение циркулирующих иммунных комплексов.

l) разводят С)п фракцию комплемента до концентрации 0,01 г/л в

ЗФР;

2) полученный раствор разливают по ),0 мл в 12 полистиреновых пробио рок, инкубация при 4 С 72 ч.

3) пробирки промывают 3 раза с помощью ЗФР; пробирки заполняют 0,017-ным растворо л желатина в ЗФР, инкубируют при +20 С 2 ч, 5) смешивают 0 1 мл пробы и 0,2 мл

ЭДТА и инкубируют в термостате при

37 С 30 мин; б) выливают из пробирок желатин (см. и.,) и промывают ЗФР 3 раза;

7) в пробирки ) - 1-б вводят по

0,05 мл разведенной пробы (см. п.5) и 0,95 мл 0,05Х.-ного раствора твин

20 в ЗФР, в пробирки )) 7 — 12 — по

1.,0 мл 0,057-ного раствора твин 20 в ЗФР, инкубируют при 37 С 1 ч;

8) пробирки промывают 3 раза ЗФР;

9) в пробирки вносят по il,0 мл антител l ão порядка к 3 классам иммуноглобулинов А, М и С разведенных

1:10 в ЗФР, по приведенной в табл.l в дубликатах.

А М ) Таблица 2

0,1

5-6

Среднее значение импульсов в минуту в дубликатах

1О

7-8

0,1

0,1

9-10

0,1

11 — 12 а

312

Вм

496

572

ВО

290

251

А а

 —  — — 100

30

531

11

Во

4534

13

14 м- и

 — В, — — 100

3 12372

Продолжение табл.1

Пробирка Антитела 1-ro порядка к им№ муноглобулинам класса

10) инкубируют при 37 С 1 ч;

11) по 1,0 мл антител 2-го порядка разведенных 1:10000 в ЗФР, вносят в чистые пробирки ¹ 13 и 14;

12) пробирки ¹ 1 — 12 промывают

3 раза с помощью ЗФР, пробирки № 13-14 закрывают притертой крышкой;

13) подсчитывают активность пробирок на счетчике -излучений;

14) результаты определяют по формулам: при использовании антител 1-го порядка к иммуноглобулину класса А; при использовании антител l-ro порядка к иммунноглобулину класса И;

G 6

<00 40

Т при использовании антител 1-ro порядка к иммуноглобулину класса С, а м G где В, В и  — количество импульсов в минуту в пробирках с пробой 4> (среднее значение дубликатов при использовании антител 1-ro порядка соответственно к иммуноглобулинам клас сов А, М и G;

В,, В,  — количество импульсов в минуту в пробирках без пробы с одним ЗФР (среднее значение дубликатов) при использовании антител 1го. порядка соответственно к иммуноглобулинам классов А, М и G >

Т вЂ” количество импульсов в минуту в пробирках с добавленными антителами 2-ro порядка без последующего

15 4 промь|вания (среднее значение дубЛикатов, пробирки № 13 и 14, т.е. общий счет добавляемых антител 2-го поряд- ка.

Результаты исследования иммунных комплексов у больной К приведены в табл.2.

Условное Пробирка обозначе- № ние

Результаты подсчета процента связывания антител показали: 0,%Х при использовании антител 2-го порядка к иммуноглобулинам класса А: 5,60Х при использовании антител 2-ro порядка к иммуноглобулинам класса М и

0,8Х при использовании антител 2-ro порядка к иммуноглобулинам класса С.

Полученные результаты указывали на превышение нормы по иммуноглобулину класса М, что свидетельствовало о нарушении иммунного статуса у больной К, т.е. о развитии системных проявлений, в частности о наличии ревматоидного миокардита. Необходи- мо применение глюкокортикоидов.

Больной назначали преднизолон в дозе 20 мг/сут. На фоне терапии наблюдалась положительная динамика суставного синдрома, Результаты исследования. через 1 месяц А 0,5Х, 7215

Составитель П.Бонарцев

Редактор Л.Пчелинская Техред В.Кадар Корректор M.ltjàpîøè

Заказ 3220/7 Тираж б60

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб, д,. 4/5

Подписное.Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная, 4

5 123

M 1,ОХ, 0,57. позволили начать сни- жение дозы преднизолона. Отмена проводилась по 2,5 мг в неделю, полностью преднизолон отменили через

2 месяца. Состояние при выпуске удовлетворительное. Результаты контрольного исследования А 0,5Х; M 0,57:

G 0,5 свидетельствовали о нормализации иммунного статуса.

Данный пример показателен в методическом плане. В составе иммунных комплексов у больной К в наличии преимущественно иммуноглобулин класса

М i при использовании известного способа определения был бы получен лож-ноотрицательный результат, так как им. иммуноглобулин G в норме.

Пример 2. Больной Д., 39 лет. Диагноз: инфекционно-аллергическая бронхиальная астма, тяжелое гечение, гормональная зависимость, астматический статус. В течение 2 недель лечения глюкокортикаидами— внутривенно капельно гидрокортизон по 250 мг/сут и перорально преднизолон по 25 мг/сут малоэффективно.

Состояние больного продолжало оставаться тяжелым. Выявление иммунных комплексов дало следующие результаты, А 1,07., М 1,07, G 2,07. Это указало на наличие выраженного нарушения иммунного статуса — аутоим— мунный вариант бронхиальной астмы, В план лечения включили циклофосфан

100 мг/сут. После 3 недель лечения наметился положительный клинический эффект, позволивший начать снижение предннзолона. Контрольное исследование: А 0,57.; М 0,57.; G 1,5%.

Пример 3. Больная Р., 2б лет. Диагноз: системная красная волчанка,, люпуснефрит, хроническое течение, активность П. При поступлении получала предниэолон 25 мг в сутки. Выявление иммунных комплек10 сов: А 07,, M 0 37., G l 57. Результаты указывают на незначительное превьш|ение нормы по иммуноглобулину класса Cl что в сочетании с нормальным уровнем других классов свидетельствовало о низкой напряженности аутоиммунного процесса и служило показанием к снижению дозы преднизолона. В течение 2 месяцеB доза была снижена до 10 мг в сутки, Контрольное исследование: А О ; М 0,37, G 1,0 нормализация иммунного статуса

В случае использования известного способа у данной больной была затруднена интерпретация результатов только по нммуноглобулину класса G, так как нельзя исключить наличие иммун-. ных комплексов с классами А и М. Толь. ко на основании имеющихся данных по трем классам можно полагать незначительный характер имеющихся нарушений иммунного статуса.

Предложенный способ позволяет выявить в составе иммунных комплексов

35 три класса иммуноглобулинов — А, М и С и с высокой точностью определить нарушение иммунного статуса.