Способ определения степени деструкции эритроцитов

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (51) 4 G OI N 33/48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTPM

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (2l) 3860552/28-14 (22) 19.02.85 (46) 15.08,86. Бюл. 11 30 (71) Институт прбблем криобиологии и криомедицины (72) А. К. Гулевский, В. В. Рязанdies и А. И. Кукушкин (53) 611-018.51(088.8) (56) Патент Японии Ф 52-37.395, кл. G OI Я 31/32, 1977.,SU„„1250952 А 1 (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ

ДЕСТРУКЦИИ ЭРИТРОЦИТОВ путем инку, бации их в среде с последующей регистрацией изменений физико-химических свойств этой среды, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью повышения точности и упрощения способа, регистрируют рН среды, при этом в качестве среды используют изотонический раствор неэлектролита, не проникающий в клетки, а степень деструкции эритроцитов рассчитывают по номограмме..

1250952

° Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения степени повреждения эритроцитов при ряде патологических состояний. 5

Целью изобретения является ловышение точности и упрощение способа за счет использования изотонической среды, содержащей неэлектролит, не ,проникающий в клетки, при этом регистрируются слабые повреждения мембран, степень которых определяется по изменению проницаемости для ионов Н

Способ осуществляют следующим 15 образом.

Исследуемую суспензию клеток вносят в ячейку серийного рН-метра, содержащую изотонический раствор не проникающего в клетки неэлектролита 20 с физиологическим рН (7,4), тоничностью, соответствующей тоничности, t исследуемой суспензии. При этом развивается диффузионный потенциал и происходит сопряженный выход анио- 25 нов С! и катионов Н . В результате этого через 20-40 с наблюдается увеличение рН, которое регистрируется рН-метром. Если мембраны клеток повреждены, рН среды увеличивается 30 пропорционально количеству разрушенных клеток.

Количество поврежденных клеток N определяют по формуле

N=100X-(Р-Я-г- щ т — х)OOX) (1) 35

R -pH . рН -рН„.„, где рН вЂ” константная величина рН, принимаемая для эритроцитов за 7,0, определяется путем внесения в измерительную ячейку с физиологическим раствором (рН 7,4)

0,2 мл контрольной суспензии эритроцитов; рН - рН в измерительной ячейке

oeûò после внесения суспензии, подвергнутой действию экстремального фактора, рН вЂ” рН в измерительной ячейке после внесения контрольной

50 суспензии клеток.

В стандартных условиях при постоянном или близком к постоянному гематокрите и для определения групп крови рН,, является константной величиной, что позволяет в целях ускорения опыта построить соответ,ствующие номограммы и определить степень деструкции эритроцитов йе посредственно по величине рН в измерительной ячейке °

Пример 1. В измерительную ячейку стандартного рН-метра, содержащую 10 мл О,?5 М сахарозы (рН 7,4), вносят 0,2 мл суспензии ннтактных эритроцитов в плазме крови (гематокрит 77% и регистрируют измерение рН. Через 20 с после начала измерения наблюдают максимальное рН 5,57, К новой порции среды измерения добавляют 0,2 мл эритроцитов, подвергнутых медленному замораживанию до -5 и 7 С и последующему отогреву в водяной бане при 37 С.

При этом регистрируют максимальное рН 6,1 .(замороженных до -5 С) и

6,65 (замороженных до -7С), Вычисленное по формуле(1) количество клеток, подвергнутых деструкции, составило соответственно 37,1 и 75,6%.

Построение номограммы. В измерительную ячейку, содержащую 10 мл

0,25 М сахарозы (рН 7,4), вносят

0,2 мл суспензии эритроцитов, полученной смешением в различном соотношении интактных клеток (гематокрит

77% )и клеток, полностью разрушенных двухкратным замораживанием — огтанванием, что контролируют по гемолизу. Максимальное рН (см. чертеж}, зарегистрированное через

20 с, увеличивается пропорциональ-, но уменьшению в суспензии количества целых клеток. Приведенная на чертеже зависимость рН среды от количества интактных клеток при данном гематокрите является номограммой для вычисления степени деструкции клеток после воздействия экстремального фактора, не связанного с внесением химических реагентов (щелочей, кислот и т.п.), существенно изменяющих рН или обладающих большой (более 2М) буферной емкостью.

Пример 2. В измерительную ячейку, содержащую 10 мл 0,25 М сахарозы (рН 7,4), вносят 0,2 мл суспензии эритроцитов (гематокрит 80X) подвергнутых нагреванию до температур 37, 49 и 54 С, выдержанных при этих температурах 10 мин и охлажденных до комнатной температуры. Зарегистрированное максимальное рН среды составляет 5,58, 6,07, 6,25 соответственно, что по номограмме чертежа означает деструкцию 1,5, 37,5 и 53,5% клеток.

1250952 мотокрите строят для каждой используемой среды инкубации.

Ъ

1 у та

Ъ

Э(1

Ь

Ъ so

Ъ М

62 5;4 9,6 58 6,0 ФГ 64- б, ф ф

Составитель А. Агуреев

Техред И.Гайдош Корректор Е, Рошко

Редактор М. Келемеш, Заказ 4403/39 Тираж 778 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Пример 3. В измерительную ячейку, содержащую 10 мл 0,25 М сахарозы (рН 7,4), вносят 0,2 мл суспенэии эритроцитов (гематокрит 77X).

Зарегистрировано максимальное рН 5,60.

Затем в измерительную ячейку с новой порцией сахарозы вносят 0,2 мл эритроцитов, предварительно обработанных в течение 5 мин 0,057-ным тритоном

Х-100. Регистрируемое при этом рН срставляет 5,9, что по номограмме чертежа означает деструкцию 247. клеток. .Номограммы зависимости рН среды от количества клеток при данном геИспользование предлагаемого способа позволяет регистрировать деструкцию клеток при дефекте мембран меньше 4- 5 A (по способу -прототипу измеряют дефекты не менее 80 А).

Точность способа не снижается при измерении в среде инкубации с криопротектором. Упрощение способа достн. гается эа счет изъятия процедуры спектрофотометрической регистрации уровня гемоглобина в среде.