Способ изготовления индикаторных полос для определения глюкозы в крови

 

Изобретение относится к медицине , а именно к способам изготовления индикаторных полос для определения глюкозы в крови. Цель изобретения - упрощение способа и повышение качества индикаторного слоя полос. .Форфатцеллюлозную бумагу пропитывают 1%-ным раствором оьлшениого сополимера винилхлорида с винилацетатом в ацетоне и высушивают. Полученную бумагу пропитывают раствором о-толидина в этаноле и сушат. На полученi ную бумагу наносят смесь, содержащую (Л ферменты, поливинилацетат и буфер. После высушивания полученную индикаторную бумагу наклеивают на полимерную основу и нарезают. 3 з.п. ф-лы, 9 табл. to Од СО О ю

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (511 4 G 01 N 33/50

1 р г

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

RO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21 ) 36 946 23/28-14 (22) 13.01.84 (46) 07.11.86. Бюл. N 41 (71) Киевский научно-исследовательский институт эндокринологии и обмена веществ и Институт физической химии им. Jl. В. Писсаржевского (72) А. П. Филиппов, И. М. Мельник, А. С. Ефимов, К. Б. Яцимирский, В. П . Комиссаренко и О. И. Синявская (53) 612.12.1(088,8) (56) Авторско свидетельство СССР

Ф 1155944, кл. G 01 N 33/50, 1981.

„„Я0„„1269021 A 1 (54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИНДИКАТОР-

НЫХ ПОЛОС ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ

В КРОВИ (57) Изобретение относится к медицине, а именно к способам изготовления индикаторных полос для определения глюкозы в крови. Цель изобретения — упрощение способа и повышение качества индикаторного слоя полос. ,Форфатцеллюлозную бумагу пропитывают

1К-ным раствором омяленного сополимера винилхлорида с винилацетатом в ацетоне и высушивают. Полученную бумагу пропитывают раствором о-толидина в этаноле и сушат. На полученную бумагу наносят смесь, содержащую ферменты, поливинилацетат и буфер.

После высушивания полученную индикаторную бумагу наклеивают на полимерную основу и нарезают. 3 з.п. ф-лы, 9 табл.

69021

0,16 г

0,04 r

Изобретение относится к медицине, а именно к способам изготовления индикаторных полос для количественного определения глюкозы в крови.

Цель изобретения — упрощение способа и повьппение качества индикаторного слоя полос°

Цель достигается тем, что вместо желатины используется один или несколько синтетических полимеров в виде растворов или дисперсий, при изготовлении индикаторных полос не требуется термостатирования наносимого состава, сушка индикаторной полосы занимает 1 5-2 ч.

Способ осуществляют следующим образом.

Наносят на полимерную подложку индикаторного слоя, включающего впитывающую целлюлозную основу (в том числе модифицированну1о катионообменную целлюлозу), глюкозооксидазу, пероксидазу, хромогенный реагент о-толидин, с последующей сушкой слоя ипи отверждением и нарезкой. При этом вместо желатины используют один или несколько синтетических или искусственных полимеров в виде растворов иди дисперсий °

Пример 1. Бумагу карбоксиметилцеллюлозную пропитывают l -ным раствором 0-толидина в этиловом спирте и высушивают при комнатной температуре 20-30 мин. Готовят смесь следующего состава:

Вода 55 мл

Глюкозооксидаза из

Penici1Iium vitaIe

РЫор1. et Bilai

Пероксидаза

Фосфатный буфер 2М (рН 5,5) 4,8 мл

Смесь при комнатной температуре перемешивают с помощью стеклянной палочки кпи магнитной мешалки в течение 5-7 мин. В результате должен получиться гомогенный раствор желтовато-коричневого оттенка, который а характеризуется плотностью Р

=1,015 г/см и вязкостью )" =1,02 сП.

Наносят смеоь на карбоксиметнлцеллюлозйую бумагу, предварительно обработанную раствором о-толидина. После высушивания при комнатной температуре в течение 40-60 мин полоса пропитывается в 0,3 .-ном растворе триацетатцеллюлозы в диоксане при соотношении пропиточного раствора к бума ге О, 7-1, 0 г на 100 см

0,37.-ный раствор триацетатцеллн лозы в диоксане готовят при комнат5 ной температуре растворением 0,9 г мелко нарезанной триацетатцеллвлозной пленки в 300 см диоксана, предо варительно перегнанного над металлическим натрием, Получаемый раствор

10 характеризуется плотностьв

=1,035 г/см и вязкостью ) =2,102 сП.

Полученную индикаторнув бумагу высушивают в течение 20 мин при комнатной температуре, наклеивают на

15 полимерную основу с помощью двухсторонней липкой ленты и разрезают на полосы необходимых раз— меров..

Индикаторная зона полученных полос в исходном состоянии имеет белый цвет с кремовым оттенком. Коэффици ент отражения полос в области 600 нм равен 61-63 . После контакта в течение 1 мик с кровью, содержащей глюкозу, и последующего смывания крови водой индикаторный слой приобретает голубую окраску. При концентрации глюкозы в крови

5,5 ммоль/л коэффициент отражения полос 44%. При концентрации глюкозы в крови 11,2 ммоль/л коэффициент отражения полос 37%. Окраска устанавливается сразу после смывания пробы и сохраняется в течение по крайней мере 20 мин.

Пример 2. Хроматографическую бумагу, содержащую карбоксильные или фосфатные группы, пропитывают 27, — ным раствором триацетатцел40 лвлозы в смешанном растворителе аце" тон — диоксан при расходе пропитыг вающего раствора 1,0-1,5 r на 100 см бумаги.

27.-ный раствор триацетатцеллвлозы готовят растворением при комнатной температуре 6 г мелко нарезанной JJ триацетатцеллвлозной пленки в 300 см смеси диоксана с ацетоном, взятых в объемном соотношении 1:1 (диоксан

50 предварительно перегоняется над металлическим натрием). Получаемый раствор характеризуется плотностьв го 3 7а

=0,9248 г/см и вязкостью

= 13,32 сП.

После высушивания в течение 10мин при 50 С бумагу пропитывают в смеси следующего состава:

Вода

Глюкозооксидаза из

Penicillium vitale

Pidopl. et, Bilai . 3,4 г

Пероксидаза 0,1 r

Фосфатный буфер 2М (рН 5,5) !2 мл

Поливинилаце тат (50 -ная водная дисперсия) 19 r д-толидин (1%-ный раствор в этаноле) 58 мл

Смесь, содержащую указанные компоненты, перемешивают с помощью стеклянной палочки или магнитной мешалки при комнатной температуре в течение 5-7 мин. Получаемая смесь должна представлять собой однородную эмульсию кремового цвета, которая го характеризуется ппо тно стью Р

=0,9846 г/см 3 и вязкостью ) =5,25 сП.

Смесь наносят в количестве 3,03,5 r на 100 см бумаги. После высуг о шивания в течение 15-20 мин при 50 С получается индикаторная лента кремового цвета, которую наклеивают на подложку с помощью двусторонней липкой ленты и нарезают на полосы. После контакта с кровью в течение 1 мин и смывания крови водой полосы окрашиваются в голубой цвет. Зависимость интенсивности окраски от концентрации глюкозы в крови (коэффициент отражения Т при ) 600 нм) показана в табл. 1

84 мл

Интенсивность окраски полос уста навливается в течение мин и не ме= няется по крайней мере в течение

30 мин:

Пример 3. 50 г порошковой карбоксиметилцеллюлозы обрабатывают

150 мл 1%-ного раствора о -толидина в этиловом спирте, перемешивая до полного удаления растворителя.

Пропитку порошковой карооксиметилцеллюлозы этанольным раствором о-толидина проводят под вытяжкой при комнатной температуре путем перемешивания стеклянной палочкой смеси карбоксиметилцеллюлозы с раствором

О -толидина до полной ее однородности.

11еремешивание (под вытяжкой) продоло жают на водяной бане при 50 С в широкой фарфоровой чашке в течение 2030 мин до получения сухого однородного порошка крембвого цвета.

1269021

0,4 г

0,1 г

12 мл

Результаты испытаний приведены в табл. 2

Получается носитель с хромагенным реагентом. Готовят смесь следующего состава:

Вода 50 мл

5 Глюкозооксидаза из

Penicillium vitа1е

Pidopl et Bilai

Пероксидаза

Фосфатный буфер 2М

10 (рН 5,5)

Поливинилацетат (50 водная дисперсия) 50 г

Носитель с хромогенным реагентом 20 г

15 Смесь, содержащую укаэанные компоненты, перемешивают стеклянной палочкой или магнитной мешалкой при комнатной температуре в течение 10!

5 мин. В результате должна полу20 читься однородная паста кремового цвета, характеризуемая плотностью

2о 3

=1,173 г/см и вязкостью =20 П.

Полученную пасту при комнатной температуре наносят через фильеру или

25 с помощью кисти — на активированную . полимерную подложку.

Смесь тщательно перемешивают и наносят на активированную полимерную подложку в количестве 6-7 г на 100 см

Э0 подложки, сушат при комнатной температуре в течение 1,5-2 ч и нарезают на полосы.

Активированную полимерную подложку получают путем погружения триаце35 атцеллюлозной пленки в ванну с 30%ным раствором щелочи (гидроокиси натрия} при 50 С на 10 мин. После щелочной обработки пленку промывают водопроводной водой в течение 10мин.

40 при 15-20 С до нейтральной реакции промывной воды, а затем прополаскивают в течение 2-3 мин в дистиллированной воде. Промытую активированную полимерную подложку сушат при ком45 .натной температуре 30-40 мин. Полученная пленка отличается от обычной исходной триацетатцеллюлозной подложки слабым матовым налетом.

Индикаторная зона полос в исход50 HoM cocTQHHHH HMeeT кремовую окрас ку. При контакте с кровью в течение

1 мин и последующем смывании крови водой полосы приобретают голубой цвет, интенсивность которого возрастает с ростом концентрации глюкозы в крови.

Интенсивность окраски полос устанавливается спустя 1 мин после смывания крови и сохраняется постоянной по крайней мере в течение 30 мин.

Пример 4. Фосфатцеллюлозную бумагу пропитывают 1%-ным раствором этилцеллюлозы.

1%-ный раствором этилцеллюлозы получают растворением 2 г порошковой этилцеллюлозы в 200 см смеси толуо- 1О

1 ла и этанола, взятых в объемном соотношении 1:1. Раствор характеризуется р =0,832 г/см, ) =0,893 сП.

Этим раствором пропитывают фосфатцеллюлоэную бумагу при соотношении 15

1,5-2,0 r указанного раствора на 7 о

100 см бумаги. Высушивают при 50 С в течение 10 мин, Полученную бумагу пропитывают 1%.— ным раствором 6:-толидина в этаноле 20 при соотношении 0,7-1,0 r раствора на 100 см7 бумаги, высушивают при 30 С в течение 15мин.На полученную бумагу наносят смесь следующего состава.

Вода 60 мп

Глюкоэооксидаза из

Penicillium vitale, РЫор1. et Bi1ai 0,2 r

Пероксидаза 0,05 г

Фосфатный буфер 2М (рН 5,5) . . 10 мл

Поливинилацетат (50% водная дисперсия) 22 г о

Смесь, содержащую указанные компоненты, при комнатной температуре перемешивают стеклянной палочкой или с помощью магнитной. мешалки в течение 5-7 мии. В результате должна получиться однородная эмульсия кремового цвета, которая характеризуется плотностью р =1 038 г/см и вязко 7 з стью =2,957 сП.

Соотношение смеси к бумаге l 0г

У

1 5 г на:100 см . После сушки в течение 40 мин при комнатной температуре получают индикаторную бумагу кремового цвета, которую наклеивают с помощью двусторонней липкой ленты на полимерную .подложку и нарезают на отдельные полосы. При контакте с кровью в течение l мин и последующем смыванхи крови водой коэффициент отражения полученных полос при

Ъ)600 нм изменяется в зависимости от концентрации глюкозы в крови, 55

Зависимость коэффициента отражения полос от концентрации глюкозы в крови дана в табл. 3. л

Окраска устанавливается через

1-2 мин после смывания пробы крови и сохраняется постоянной по крайней мере в течение 30 мин.

Пример 6. Хроматографическую бумагу, содержащую карбоксильные или фосфатные группы, пропитывают

2%-ным раствором уретанового каучука в этилацетате при соотношении 1 07

l,5 г раствора на 100 см бумаги, высушивают при комнатной температуре в течение 30 мин, 2%-ный раствор каучука готовят растворением при комнатной температуре 4 г мелко нарезанного каучука в 200 см этилацетата. Получаемый

3 раствор характеризуется плотностью

2о з 70

=0,897 г/см и вязкостью

=0,772 сП.

На полученную бумагу наносят смесь следующего состава:

Вода 84 мл

Глюкозооксидаза из

Penicillium vitale

Pidopl. et Bile, Пероксидаза

0,4 г

О,1 r

21 Ь

Пример 5. Фосфатцеллюлозную бумагу пропитывают !7.-ным раствором омыленного сополимера винилхлорида с винилацетатом А-15-0 в ацетоне при соотношении 1,5-2,0 r раствора на

100 см бумаги, высушивают в тече7 ние 10 мин при. 50 C.

17.-ный раствор омыленного сополимера винилхлорида с винилацетатом

А-15-0 готовят растворением при комнатной температуре 2 r сополимера

3 в 200 см ацетона. Полученный раст70 вор характеризуется плотностью

=0,7895 г/см и вязкостью у

=0,547 СП.

Полученную бумагу пропитывают 1%ным раствором о -толидина в этаноле при соотношении 0,7-1,0 r раствора на 100 см бумаги, сушат при 50 С в течение 10 мин. На полученную бумагу, наносят смесь, содержащую ферменты, поливинилацетат и буфер, как в примере 4. После высушивания при 50 С в течение 20 мин полученную индикаторную бумагу наклеивают на полимерную основу и нарезают. Аналитические характеристики получаемых таким образом полос выражаются следующей зависимостью коэффициента отражения полос от концентрации глюкозы в крови, которая представлена в табл. 4.

7 1269021

Фосфатный буфер 2М г (рН 5,5) 12 мл

Поливинилацетат к (SOZ-ная водная дисперсия) 5 т

0 -толидин (1Х вЂ” ный раствор в этаноле) 58 мл н

Смесь готовят как в примере 2.

При контакте полос с кровью в течение 1 мин и последующем смывании 10 крови коэффициент отражения полос в области h > 600 нм зависящий от кон- б, центрации глюкозы в крови, представ- н лен в табл. 5.

19 r

0,2 r

0,05 г

Интенсивность окраски полос не меняется по крайней мере в течение

30 мин после смывания пробы.

Пример 7. Бумагу карбоксиметилцеллюлозную пропитывают 2 -ным раствором нитрильного каучука в метилэтилкетоне при соотношении 1-01,5 r раствора на 100 см бумаги, высушивают при комнатной температу ре в течение 30 мин.

Для приготовления 2Х-ного раствора каучука 4 r мелко нарезанного каучука растворяют при комнатной температуре в 200 см метилэтилкетоЪ на. Получаемый раствор характериэуго ется плотностью Р =0,806 гlсм и вязкостью =0,718 сП.

Затем пропитывают 1 -ным раствором 0 -толидина в этаноле при соотношении: 0,7-1, 0 г раствора на 100 см бумаги, сушат при комнатной температуре 20-30 мин.

На полученную бумагу наносят смесь следующего состава.

Вода 60 мл

Глюкозооксидаза из

Penicillium vitale

Pidopl. et Bilai

Пероксидаза

Фосфатный буфер 2И (рН 5,5) 10 мл

Поливинилацетат (50 .-ная водная дисперсия) 22 r

Смесь готовят как в примере 4.

Наносимый состав и пропитываемую бумагу берут в соотношении: 0,8-1,2 r смеси на 100 см бумаги. После сушки г при комнатной температуре в течение

1 5-2 ч индикаторную бумагу кремового цвета наклеивают на.подложку и нарезают как и в предыдущих примерах, При контакте с кровью в течение

1 мин и последующем смывании водой олубая окраска полос (Т при Л >600нм) ависит от концентрации глюкозы в рови следующим образом.

Результаты испытаний даны в абл. 6.

Окраска полос стабильна в течеие 20-30 мин.

II р и м е р 8. Бумагу карбоксиетилцеллюлозную пропитывают l .-ным аствором 6 -толидина при соотношении 1,0-1,5 г раствора на 100 см умаги, высушивают при 300 С в течео ие )5 мин, после чего на нее наносят смесь следующего состава:

Вода 55 мл

Глюкозооксидаза из

Penicillium vitalle

Pidopl. et Bilai 0,16 r

Пероксидаэа 0,04 г

Фосфатный буфер 2М (рН 5,5) 4,8 мл

Смесь готовят как в примере 1.

Смесь наносят при соотношении

1,0-1,5 r на 100 см бумаги. После

25 сушки при 50 С в течение 20 мин поо лученную бумагу пропитывают 0,1 ным раствором ацетобутиратцеллюлоэы в этилацетате при соотнопении 0 81

Ф

1,2 г раствора íà IGO см бумаги.

IX-ный раствор ацетобутиратцеллюлозы готовят растворением при комнатной температуре 0 2 r поронкообt разного полимера в 200 см этилацетата. Получаемый раствор характеризуется плотностью p =0,891 г/см и вязкостью 2 =0,668 сП.

Индикаторную бумагу сушат при

Ю комнатной температуре в течение

20 мин, наклеивают на подложку и нарезают на полосы.

IIpH KoHTaK e e KpoBbY) в течение

1 мин и последующем смывании крови водой интенсивность окраски полос (T приЯ >600 нм) зависит от концент рации глюкозы.

Результаты испытаний даны в табл. 7 °

Окраска полос сохраняется постоянной в течение 20-30 мин.

Сравнительная характеристика предлагаемого способа изготовления индикаторных полос для определения глюкозы в крови и известного приведены в табл. S.

55 Зависимость коэффициента отражения (g) индикаторных полос от времени, прошедшего после смывания крови, 1269021

10 связывающего компонента в индикаторный слой вводят один или несколько синтетических и (или) искусственных полимеров, при этом используют раст5 воры полимеров в органических раст- . ворителях.

2. Способ по п. 1, о т л и ч аю шийся тем, что в качестве синтетических полимеров используют

111 поливинилацетат, нитрильный каучук, уретановый каучук, омыленный сополимер винилхлорида с винилацетатом.

Формула изобретения

1. Способ изготовления индикаторных полос для определения глюкозы в крови, включающий нанесение на полимерную подложку индикаторного слоя, в состав которого входят целлюлоэная основа, выполненная в виде бумажной ленты либо в виде порошка, глюкозооксидаза из Penicillium vitale Pidopl et Bilai, пероксидаза, хромогенный реагент о-толидин, буфер и связывающий компонент с последующим высушиванием слоя или его отверждением и нарезкой, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения качества индикаторного слоя полос, в качестве

Таблица 1

Сг.,.39 . ммоль/л 0 4,4 9 5 3,3 21,6

T Х 69 44 32 27 21

Таблица 2

С ГЮО ЗИ В ммоль/л 0 2,8 6, 7 15.,0 22, 8

Т, Х 63 52 41 30 23.

Таблица 3

Показатели Проба

Цельная кровь

С „, „р. „Ммоль/л

2,8 5,0 7,8

11,7 16,1 23,3

63 58 52 47 41

T=-70 X

Сухая полоса

Полоса, смоченная водой

T=69X

9 показана в табл. 9,(время контакта с кровью 60 с., С,„„„„„154 мгЕ ) .

3. Способ по пп. 1 и 2, о т л ич а ю шийся тем, что используют дисперсию поливинилацетата в воде.

4. Способ по и. 1, о т л и ч аю шийся тем, что в качестве искусственных полимеров используют

2б триацетатцеллюлоэу, этилцеллюлозу, ацетобутиратцеллюлоэу.

1269021

Таблица 4

Проба

Показатели

Цельная кровь

36

61

Т, X

Т=71X

Сухая полоса

Полоса, смоченная водой

T=68X

Таблица 5

Показатели

Проба

47 38

22

T=68X

T=69X

Таблица 6

0 6ю1 10â5 15э5 20эО 22 2

68 48 41 37 33 31.

Т, %

Таблица 7

С гнюкозы э ммоль/л 0 5,0 10,0 13 9 21 0

70 58 51о 46 40

Т, Е

Цельная кровь

Ср,ыо ы ммоль/л

Т, 7.

Сухая полоса

Полоса, смоченная водой

Сгиюкозы в ммоль/л

Зу9 8,3 14,5 21 l

3,3 6,1 12,8 18 9 23,3

1269021

Таблица 8

Показатели по способу

УсЛовия процесса известному . предлагаемому

Время сушки бумажной ленты после нанесения индикаторного состава, ч

А,.

4-6

1,5-2,0

Температура наносимого

-состава, С о

10-60

40-45

Т а б л и ц а 9

Коэффициент отражения, Ж, после смывания крови, мин

Способ

0 0>5 1 1в5 2 2>5

44 43 43 43 43 43

49 46 44 43 42 42

Составитель М. Позняк

Редактор О. Головач Техред П„Сердюкова Корректор М, Демчик

Заказ 6028/46 Тираж 778 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35 ° Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул, Проектная, 4

Необходимость в термостатироваиии при нане. Ь. сенин индикаторного состава

Предлагаемый

Известный

Обязательно, поскольку вязкость наносимого состава зависит от температуры

Не надо, вязкость наносимоro состава практически не зависит от температуры