Способ определения аденозинмонофосфата в ткани мозга

 

Изобретение относится к биохимии , а именно к биоэнергетике, предназначено для определения концентрации аденозинмонофосфата (АМФ) при компл ексном изучении аденозинтрифосфата (АТФ) .Цель изобретения - упрощение способа путем сокращения числа стадий при определении аденеиловых нуклеотидов.Для этого определяют АТФ в ткани мозга , рассчитывают концентрацию АМФ по математической формуле у Ч„ х + + X + 4, X + Ч з , где у - концентрация АМФ; X - концентрация АТФ; f , f , Ч , Ч з - постоянные величины. В случае применения способа при гипоксическом воздействии нужно дополнительное действие - измерение времени (t) пребывания животного в гипоксическом состоянии и по содержанию АТФ с учетом t пребывания в условиях гипоксии определяют концентрацию АМФ, 4 табл., 1 з.п.ф-лы. S сл со о ю со оо

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (50 4.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

Н А ВТОРСН0МУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 395) 427/28-14 (22) 02.09,85 (46) 07.04.87. Бюл,й 13 (71) Горьковский государственный медицинский институт им. С,M,Кирова (72) Е,М.Хватова, В.M,Ãàëêèí, А.Н, Мошкова, Г,В.Миронова и А,Н,Сидоркина (53) 616.07(088.8) (56) Шумащова Е,Н. и др, В сб, Дегирогеназы в норме и патологии, Горький, 1980, с.43-50. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДЕНОЗИНМОНОФОСФАТА В ТКАНИ МОЗГА (57) Изобретение относится к биохимии, а именно к биоэнергетике, предназначено для определения концентрации аденозинмонофосфата (АМФ) при

„„Я0„„1302198 А 1 комплексном изучении аденозинтрифосфата (АТФ).Цель изобретения — упрощение способа путем сокращения числа стадий при определении аденеиловых нуклеотидов.Для этого определяют АТФ в ткани мозга, рассчитывают концентрацию АМФ по математической формуле у =V х +

+М.х + 4 .х+ Ч, где у - концентрация АМФ; х — концентрация АТФ;

Ч, V, Т, Ч вЂ” постоянные величины. о i ° g 3

В случае применения способа при гипоксическом воздействии нужно дополни- тельное действие — измерение времени (t) пребывания животного в гипоксическом состоянии и по содержанию

АТФ с учетом t пребывания в условиях

С> гипоксии определяют концентрацию АМФ.

4 табл,, 1 з,п,ф-лы, С:! 302 1

98

Продолжение табл.1

-17,480896 !

Ор257653

1,660693

l,627649 концентрация АМФ; экспериментально полученное содержание АТФ; эмпирические коэффициенты функции <1, (/t), указанные в таблицах; время пребывания в состоянии гипоксии.

Ао . Ав,A

0,0341496

-0,432814

-1,7661524

9,797265

А, Ч (t) Ч,(с)

v,(i ) Ч (t) 8,956371

-22,472298

353 58

20,748186,13„548997

358,15

-!2„801555

0 394186

139,0

0,263980

410,81

-7,567743

П р и м е ч а н и е. Атмосферное давление 290-310 мм рт„ст, Таблица (.. (1, y (t) V2(t),() А,. 9 (t) 0,815949

621,79449

1,760388

621,79449

22,551407

А -0,258331 1,252948

A 621,79449 621,79449

A2 . 3,348475 -15,955927

-О 061891

П р и м е ч а н и е, Атмосферное давление 270-290 мм рт,ст, Изобретение относится к биохимии, а именно к биоэнергетике, и может использоваться для определения концентрации аденозинмонофосфата (АИФ) при комплексном изучении содержания 5 аденозинтрифосфата (АТФ), Цель изобретения — упрощение спосоСа за счет сокращения числа стадий при комплексном определении аденеиловых нуклеотидов.

Способ осуществляют следующим образом.

Проводят прижизненную фиксацию мозга мгновенным замораживанием, определяют содержание АТФ в ткани мозга

l5 любым известным методом, а затем рас-: считывают концентрацию АМФ по математической формуле у=Я, ° х + p.х +Ю .х+f, (1) 20 где у " концентрация А11Ф; х — концентрация АТФ;

Ч,9,, P,, - постоянные величины, В случае применения предлагаемого способа у интактных животных функции принимают постоянные значения, укаэанные в табл,1, Таблица 1

В случае применения предлагаемого способа при гипоксическом воздействии требуется дополнительное действие — измерение времени пребывания животного в гипоксическом состоянии и расчет переменной функции Ч (г.) по

1 эмпирическим коэффициентам А,А,А о t 2 выбранным из соответствующих таблиц, При этом формула принимает вид: у = Ч,(t)х + q (С)х + q (t)x +

+ () (2) где g,(t) = А + А, . соз(-<), 1=0,1, А

2, 3);

Значения А, А, А для функций о (t) при гипобарическсй гипоксии

1 представлены в табл,2 и 3, при ишемии — в табл,4.

Таблица 2

1302198

Таблица 4

3,9562274

1119,78

-1,8941859

12,230367

1274,47

-4,7790863

А,. V,(t) Ч(с) А О, 5686278 4, 8439768 о

А 2477,9 1266) 69

А -О, 2775826 1,9613424

Пример 1, Берут интактное животное (крысу весом 170 r) и целиком замораживают в жидком азоте, Замороженный мозг извлекают и растирают в порошок в ступке с жидким азотом. Навеску ткани берут в предварительно тарированный бюкс, содержащий слегка замороженный 10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты, приготовленный на 0,5 M ЭДТА из расчета 10 мл/г ткани. Пробу экстрагируют в течение 20 мин и фильтруют .через бумажный фильтр. Трихлоруксусную кислоту удаляют трехкратным встряхиванием с двумя объемами серного эфира, насыщенного водой. Следы эфира удаляют аэрацией. Экстракт нейтрализуют до рН 7,0 — 7,4 0,1 н. раствором Na0H. Содержание АТФ опре. деляют любым известным методом, В данном случае использован метод колоночной хроматографии на эктеола- 35 целлюлозе в ff -форме.С колонки АТФ элюируется 0,05 н, раствором НС1 .

Затем конечную концентрацию HCf доводят до 1,0 н, Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при 4р длине волн 260 — 290 нм. Содержание АТФ выражают в мкМ на 1 г сырой ткани мозга, Экспериментально установленное содержание АТФ в мозгу испытуемого животного равно 2,08 мкМ/г. 45

Выбирают из табл,l значения функций

@,(t), Ч (t), Р (t), У (t) и подставляют в формулу (1), Рассчитывают концентрацию АИФ: у = 0,26137752. Аналитически рассчи- 5р танное значение концентрации АМФ равно 0,26137752. Экспериментально установленная концентрация АИФ в мозгу крыс в данных условиях равна

0,27+0,02, Ошибка формулы составля- 55 ет 3,19%.

Пример 2, Берут интактное животное (кролик весом 2,6 кг). Производят прижизненную фиксацию мозга замораживанием в жидком азоте, Готовят экстракт мозга (с охлаждением) и определяют содержание АТФ хроматографическим методом на эктеола-целлюлозе. Экспериментально установленное содержание АТФ в мозгу испытуемого животного равно ),76 мкМ/r, Выбирают из табл,l значения функций

Ч,(С), Р (t), Ч (t), М (t) и подставляют в формулу, Рассчитывают концентрацию АМФ: у = 0,2106.178. Аналитически рассчитанное значение концентрации АМФ равно 0,2106178. Экспериментально установленная концентрация

АИФ в мозгу равна 0,22 + 0,019. Ошибка формулы составляет 4,26Х, Y.(t) = А„+ Я cos(- ), (3)

А

1 где у — содержание АТФ; х — концентрация АМФ;

T - время, мин;

А,,А,, А — коэффициенты линии регрессии р,(t) .

Пример 3. Помещают животное. (кролик весом 2,7 кг) в проточную барокамеру, путем разрежения воздуха достигают атмосферного давления

270 мм рт.ст., что соответствует высоте 8000 м, Измеряют время пребывания животного на "высоте" 8000 м—

15 мин. После извлечения животного из барокамеры производят прижизненную фиксацию мозга замораживаиием в жидком азоте, Готовят экстракт мозга .(с охлаждением) и определяют содержание АТФ хроматографическим методом на эктеола-целлюлозе, Эксперименталь1 но установленное содержание АТФ в мозгу испытуемого животного равно

1;45 мкИ/г. Выбирают из табл.3 значения коэффициентов А,А,А, для соответствующего расчета функций e,(t), Ю,(t), Ч (т.), Чa(t). Рассчитывают по формуле < (t) = А„ +

130219

Aä

+ А: cos (-") соответствующие знао t чения сР,.(с), = 0,1,2,3.

Рассчитывают гР (t) при t = 15 о

Значения коэффициентов A, = 5

= -0,258331; А, = -621,79449; А

Зв348475; о(t) = 3 5598801.

Рассчитывают )-г",(с) при t = 15

Значения коэффициентов А, = -1,252948; A, = 621,79449; А = 10

15ь955927в Y)(t) = 14в930578 °

Рассчитывают з (с) при t = 15

Значения коэффициентов А„. =

1, 760388; А, = 621,79449," A =

22,551407 гр (t) = 21,110794, 15 2 !

Рассчитывают Ч (t) при t = 15

Значения коэффициентов А = 0,815949;

А = 621,79449; А = 9,061891; гг (с) = -9,7296228„

Экспериментальное значение АТФ и 20 рассчитанные значения функций ч (с), „(с), V (с), V, (с) подставляют

)3 формулу (2) и вычисляют концентрацию АМФ, соответствующую данным условиям опыта (степень разрежения атмосферы в барокамере соответствует

8000 м, время пребывания животного в барокамере 15 ), у = Y,(t)x + г(с)х а(с)х ь (с), х P, (t) -- 3,5598801; М, (с) = 30

14>930578> Ч (с) = 21ю110794q (t) = -9,7296228, у = 0,342228.

Аналитически рассчитанное значение концентрации АМФ равно 0,342228„

Экспериментально установленное количество АМФ в мозгу животного в данных условиях опыта равно 0,35+ 0,044. Ошибка формулы составляет

2,27, Пример 4, Помещают животное 40 (кролик весом 2,8 кг) в проточную барокамеру, путем разрежения воздуха достигают атмосферного давления

310 мм рт,ст,, что соответствует высоте 7000 м, Измеряют время пребыва- 45 ния животного на высоте 7000 м (60 мин). После извлечения животного из барокамеры производят прижизненную фиксацию мозга замораживанием в жидком азоте. Готовят экстракт мозга 50 (с охлаждением) и определяют содержание АТФ хроматографическим методом на эктеола-целлюлозе. Экспериментально установленное содержание -АТФ в мозгу испытуемого животного равно 55

1,85 мкМ/г. Выбирают из табл,2 значения коэффициентов А,А „А для соотУ 1 В g ветствующего расчета функций 4 (t), Ч,(с), " (t), Ч (с), Рассчитывают

8 б в А по формуле Ч; (с) = А ° + A, cos(" ) соответствующие значения 4 ;(С), = 0„1,2,3 °,(t) при с = 60

Значения коэффициентов А, = 0,394186; А,, = 139; А = 0,263980;

V,(t) = -0,00351895. Ч,(с) при с — 60

Значения коэффициентов A, =

13,548997; А = 358,15; А =

= — 12,801555; М,(t) = 0,084896. P (с) при с = 60, Значения коэффициентов А, =

-22,472298; А, = 353,581 А г — 20,748186", У (t) = -0,035071, М (t) при t = 60

Значения коэффициентов А, =

= 8,956371; А = 410,81; Аз =

= --/,567743; М (с) = 0,0031848.

Экспериментальное значение АТФ рассчитанные значения функций +, (с)

4,(t), М (t), гг" (с) подставляют в формулу (2) и вычисляют концентрацию АМФ, соответствующую данным условиям опыта (степень разрежения атмосферы в барокамере соответствует

7000 м, время пребывания животного в барокамере t = 60 ): у = V.(t)x +

+ P,(t)х + Г (с)х + Ч (t); х = !,85

М,(с) = -0,00351895; 4,(t)

= о,084896; . г (с) = -0,35071;

У (t) = 0,0031848; у = 0,20605645, Аналитически рассчитанное значение концентрации АМФ равно

0,20605645, Экспериментально установленное количество АМФ в мозгу животного в данных условиях опыта равно 0,19)

+ 0,027, Ошибка формулы 8,457, Пример 5, Берут животное (крысу весом 180 г), дают легкий эфирный наркоз, делают перевязку правой и левой сонных артерий, Измеряют время пребывания животного в условиях ишемии — 240 мин. Крысу целиком быстро замораживают в жидком азоте, Готовят экстракт мозга (с охлажден кием) и определяют содержание АТФ хроматографическим методом на эктеола-целлюлозе, Экспериментально установленное содержание АТФ в мозгу испытуемого животного равно

2,13 мкМ/".. Выбирают из табл,4 значения коэффициентов А,, А„., А для соответствующего расчета функций

,(с) „М,(t), М, ;t) "з(t) . Рассчитывают по формуле t (t) = A A

А х cos (- ) соответствуюшие значения с

1302198

У =4, Составитель Н, Гуляева

Редактор Н, Тупица Техред И.Пспович, КорректоР С,Шекмар

Заказ 1212/44 Тираж 777 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул.Проектная,4

М;(t), i = О, 1,2,3. 4 (t) при t

= 240

Значения коэффициентов А, =

= -0,5686278; А = 2477,9; v,(t)

= 0,0759685. Р,(с) при с = 240

Значейия коэффициентов А, =

= -4,8439768; A = 1.266,69; А ц =

1,9613424; P, (с) = -0,6341911. P (t) при t = 240, Значение коэффициентов А, = 12,230367; А, 1274,47; А = -4,7790863; Ч,(с)

2,1055218. з(с) при с.= 240 °

Значения коэффициентов А, = 3,9562274; А< = 1119,78; А = 15

= -1,8941859; Ф (с) = -2,0786331, Экспериментальное значение АТФ и рассчитанные значения функций Ч,(с), V,(с), r (с), Ч (с) подставляют в формулу (2) и вычисляют концентрацию 20

АМФ, соответствующую данным условиям опыта (перевязка правой и левой сонных артерий; время после операции .с = 240 ) у = .0,2629956.

Аналитически рассчитанное значение концентрации АМФ равно 0,2629956, Экспериментально установленное количество АИФ в мозгу животного в данных условиях опыта равно 0,25 +

+ 0,04. Ошибка формулы составляет

5,27.

Формула изобретения

1, Способ определения аденозинмонофосфата в ткани мозга путем исследования мгновенно замороженной ткани, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа sa счет сокращения числа стадий при комплексном определении аденеиловых нуклеотидов, в ткани мозга измеряют содержание концентрации аденозинтрифосфата, а концентрацию аденоэинмонофосфата определяют по формуле: где у - концентрация аденозинмонофосфата; х — концентрация аденозинтрифосфата;

М Т % — постоянные величины, з

2, Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью определения аденозинмонофосфата в мозге в условиях гипоксии, дополнительно измеряют время пребывания животного в условиях гипоксии и по содержанию аденозинтрифосфата с учетом времени пребывания в условиях гипоксии определяют концентрацию аденоэинмонофосфата,