Способ определения метгемоглобинредуктазной активности эритроцитов

 

Изобретение относится к биохимии и клинической гематологии, предназначено для определения метгемоглобинредуктазной активности эритроцитов. Цель изобретения - повьшение точности и ускорение способа за счет сокращения числа стадий. Для этого эритроциты гепаринизированной крови отделяют от плазмы центрифугированием, трижды отмывают в буфере рН 7,4, содержащем 0,01 М КН Pq, /К НРО и о, 8% NaCl. К осажденным эритроцитам добавляют равный объем 0,5%-ного нитрата натрия на физиологическом растворе, смесь инкубируют 10 мин, за это время окисляется 85-95% гемоглобина. Затем эритроциты 5-кратно отмьгоают в фосфатном буфере. Две пробирки с равными объемами нитритных эритроцитов инкубируют 3 ч при 37°С. В одной пробирке 10 мМ глюкозы и метиленового синего, в другой добавки отсутствуют. В термостатирующую ячейку , содержащую 1 мл пробы, при перемешивании 37 °С вносят К Fe(CN), 3 о И регистрируют изменение окислительно-восстановительного потенциала суспензии с помощью платинового электрода Э11В-14, хлорсеребряного электрода ЭВЛ-1 МЗ на рН-метре рН-121, с выхода которого сигнал подается на . самописец КСП-4. Скорость восстановления феррицианида калия определяют по времени восстановления стандартного количества KjFe(CN)g и выражают в ммоль Fe/л эритроцитов/ч.;Значения этой скорости, характеризующие метгемоглобинредуктазную активность, возрастают во времени в пробе с глюкозой и метиленовым синим и не изменяются в пробе без добавок (контроль ). 1 табл. ю (Л оо о N3 СО о:

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (sD 4 6 01 N 33/48 33/49 в1 P ry r . -„ >

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н Д BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Fi 1;

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3758663/28-14 (22) 18.05.84 (46) 07.04.87. Бюл. 13 (71) Институт зоологии АН КазССР и Казахский научно-исследовательский институт онкологии и радиологии (72) З.С. Токтамысова, Н.Х. Биржанова и Б.С. Балмуханов (53) 612.015(088.8) (56) Кушаковский М,С. Клинические формы повреждения гемоглобина. — Л.:

Медицина, 1968, с. 159. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТГЕМОГЛОБИНРЕДУКТАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ (57) Изобретение относится к биохимии и клинической гематологии, предназначено для определения метгемоглобинредуктазной активности эритроцитов.

Цель, изобретения — повьппение точности и ускорение способа за счет сокращения числа стадий. Для этого эритроциты гепаринизированной крови отделяют от плазмы центрифугированием, трижды отмывают в буфере рН 7,4, содержащем

0,01 М КН РО /К НРО„ и 0,8Ж ИаС1.

К осажденным эрйтроцитам добавляют равный объем 0,57-ного нитрата нат„„SU„„1302196 А 1 рия на физиологическом растворе, смесь инкубируют 10 мин, за это время окисляется 85-957 гемоглобина. Затем эритроциты 5-кратно отмывают в фосфатном буфере. Две пробирки с равными объемами нитритных эритроцитов инкубируют 3 ч при 37 С. В одной пробирке 10 мМ глюкозы и 2.10 М метиленового синего, в другой добавки отсутствуют. В термостатирующую ячейку, содержащую 1 мл пробы, при перемешивании 37 С вносят 10 4 M К Fe(CN) з б и регистрируют изменение окислительно-восстановительного потенциала суспензии с помощью платинового электрода ЭПВ-14, хлорсеребряного электро- ф да ЭВЛ-1 МЗ на рН-метре рН-121, с выхода которого сигнал подается на самописец КСП-4. Скорость восстанов- ф ления феррицианида калия определяют по времени восстановления стандартного количества КЗЕе(СИ)б и выражают в ммоль Fe/ë эритроцитов/ч., Значения этой скорости, характеризующие мет- 1 „ гемоглобинредуктазную активность, С возрастают во времени в пробе с глюкозой и метиленовым синим и не изменяются в пробе без добавок (конт. роль). 1 табл.

1 l 30219

Изобретение относится к биохимии и клинической гематологии и может быть использовано для определения метгемоглобинредуктазной активности эритроцитов.

Цель изобретения — повышение точности и ускорение способа за счет сокращения числа стадий.

Способ осуществляют следующим образом.

Эритроциты гепаринизированной крови отделяют от плазмы центрифугированием, трижды отмывают в буфере рН 7,4, содержащем 0,01 М КН PO /

/К НРО и 0,8 NaC1. К осажденным эритроцитам добавляют равный объем

0,5 †но нитрита натрия, приготовленного на физиологическом растворе, и смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин, 3а это время окисляется 85-95% гемоглобина.

После инкубации эритроцита 5-кратно отмывают от нитрита в фосфатном буфере. Готовят 3-4%-ную суспензию эритроцитов в Кребс-Рингер фосфатном буфере (120 мМ NaC1, 4,8 мМ КС1, 1,3 мМ СаС1, 1,2 мМ NgSO, 16,5 MM

Ъ

ИаН РО /Na ЙРО, pH 7,4). Две про2 бирки с равными объемами нитритных эритроцитов помещают в качалку и инкубируют 3 ч при 37 С, причем в одной пробирке присутствует 10 мМ глюкозы и 2 10 M метиленового синего, а в другой пробирке добавки отсутствуют. В термостатируемую ячейку, со35 держащую 1 мл пробы при 37 С при лев ремешивании вносят 10 M К Fe(CN) и

6 регистрируют изменение окислительновосстановительного потенциала суспензии с помощью платинового электрода и хлорсеребряного электрода на рНметре, с выхода которого сигнал подается на самописец. Скорость восстановления феррицианида калин определяют по времени, необходимому для восстановления стандартного количества К Fe(CN), и выражают в мМ ГF/:.i эритроцитов/ч. Значения этой скорости, характеризующие метгемоглобинредуктазную активность, возрастают во времени в пробе с глюкозой и метиленовым синим и не изменяются в пробе без добавок (контроль)..

Пример. Используют суспен55 зию эритроцитов, содержащую 6,03"

° 10 М гемоглобина.

Относительные изменения скорости

1 восстановления феррицианида калия во времени представлена в таб— лице.

Время Т (сравнение за равные промежутки времени при инкубации) Относительные изменения скорости восстановления феррицианида калия,7

Т -Т /Т -Т

20 10 10 0

Т -Т /Т -Т

50 20 20 О

Т -Т /Т -Т

40 30 50 20

Т -Т /Т -Т

Ч5 40 40 30

Т -Т /Т -T

55 50 50 45

-Т /Т -Т

60 55 55 50

70

67

38

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

Способ определения метгемоглобинредуктазной активности эритроцитов путем обработки эритроцитов нитритом натрия, инкубации с субстратами и кофакторами с последующим определением активности по скорости восстановления метгемоглобина, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения точности и ускорения способа за счет сокращения числа стадий, после инкубацни к суспензии цельных эритроцитов добавляют феррицианид калия, а скорость восстановления метгемоглобина определяют по скорости восстановления феррицианида, регистрируемой потенциометрическй.

Проводят касательную к начальному участку кривой зависимости скорости от времени и определяют,что за 10 мин изменения скорости восстановления феррицианида калия 3,1 мМ Fe/ë эритроцитов/ч, а изменения скорости восстановления феррицианида калия,отнесенные ко времени 1 мин,, 0,,31 мМ

Fe/ë эритроцитов/ч. Проводя дальнейшие преобразования, получают,что скорость восстановления феррицнанида калия равна 5,17 мМ Fe/ìèí, что в пересчете на 1 гем составляет 1,30 мМ

Fe/ìèí — метгемоглобинредуктазная активность эритроцитов в данной пробе.