Способ диагностики нарушения липидного обмена

 

Изобретение относится к медицине , предназначено для определения нарушения липидного обмена в клинической практике. Цель изобретения - упрощение способа и повьппение точности диагностики. Для этого пробу крови пациента центрифугируют с этиленлиаминтетраацетатом натрия (ЭДТА). Отделяют плазму, из которой после центрифугирования с фиколом выделяют тромбоциты. Выделенные тромбоциты осаждают центрифугированием, промывают , гомогенизируют в растворе сахарозы и ЭДТА. Гомогенат делят на две части, к одной из которых добавляют ь-лецитин, а к другой - глицил-Ь фенилаланин-, Ь-нафтш1амид. Образцы инкубируют в течение 30 мин, | при 37°С и радиометрически на сцинцилляционном счетчике определяют активность продуктов гидролиза фосфолипазы А, а продукт гидролиза катепсина С - свободный -нафтиламин определяют спектрофлюориметрически при волне возбуждении 366 нм и волне испускания 414 нм. Активность фосфолипазы А определяют по формуле Аф (С-Р) t 100-0,5-Сб, где С - концентрация субстратаi Р - % гидролизаJ t - время инкубации; С - концентрация белка. Активность катепсина С определяют по формуле Ац (F-C) : ( х X 0,1-Со, где F - интенсивность флюоресценции анализируемого гомогената тромбоцитов; t - время инкубации, Fg - интенсивность флюоресценции стандартного раствора /ь-нафтиламина; С„ - концентрация белка. Активность в ферментов выражают, в наномолях субстрата , гидролизованного за 1 мин 1 мг белка. Количество фосфолипазы А, в норме 0,57 + 0,07 нмоль/мин/мг белка, катепсина С - 1,68 + 0,27 нмоль/мин/ /мг белка. При увеличении этих значений выше 2,5 и 1,2 нмоль/мин/мг белка диагностируют нарушение липидногр обмена. 1 табл. § (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСН ИХ

РЕСПУБЛИН

ЛК 13246 7 1)4 А 61 В 5/00 G 01 N 33/49

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ :" ..

Н ABT0PCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3988659/28-!4 (22) 06.12.85 (46) 23.07.87. Бюл. У 27 (71) Институт питания ANH СССР (72) В.А.Тутельян, А.В.Васильев, М.A.Ñàìñîíîâ, А.В.Погожева и Н.П.Шимановская (53) 616.071(088.8) (56) Самсонов M.À., Тутельян В.А., Погожева А.В., Бурман Э.Ф. Тер. архив, 1983, Ф 5, с. 56-59. (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НАРУШЕНИЯ

ДИПИДНОГО ОБМЕНА (57) Изобретение относится к медицине, предназначено для определения нарушения лплидного обмена в клинической практике. Цель изобретения упрощение способа и повышение точности диагностики. Для этого пробу крови пациента центрифугируют с этилендиаминтетраацетатом натрия (ЭДТА).

Отделяют плазму, из которой после центрифугирования с фиколом выделяют тромбоциты. Выделенные тромбоциты осаждают центрифугированием, промывают, гомогенизируют в растворе сахарозы и ЭДТА, Гомогенат делят на две части, к одной из которых добавляют .. -лецитин, а к другой — гли= цил — L-фенилаланин-,Ъ-нафтиламид. Образцы инкубируют в течение 30 мин, при 37 С и радиометрически на сцинцилляционном счетчике определяют активность продуктов гидролиза фосфолипазы A„, а продукт гидролиза катепсина С вЂ” свободный р-нафтиламин определяют спектрофлюориметрически при волне возбуждении 366 нм и волне испускания 414 нм. Активность фосфолипазы А„ определяют по формуле А = (С.Р) t -100-0,5 ° С, где С вЂ” концентрация субстрата; P — X гидролиэа, время инкубации; С вЂ” концентрация белка. Активность катепсина С определяют по формуле А „ = (F ° С) : (Р t x х 0,1 С, где Р— интенсивность флюоресценции анализируемого гомогената тромбоцитов; t — время инкубации, F з — интенсивность флюоресценции стандартного раствора р-нафтиламина;

С вЂ” концентрация белка. Активность

6 ферментов выражают. в наномолях субстрата, гидролизованного за 1 мин t мг белка. Количество фосфолипазы А, в норме 0,57 + 0,07 нмоль/мин/мг белка, катепсина С вЂ” 1,68 + 0,27 нмоль/мин/

/мг белка. При увеличении этих значе— ний выше 2,5 и 1,2 нмоль/мин/мг белка диагностируют нарушение липидного обмена. 1 табл.

1324637

Активность фосфолипазы Л, определяют по формуле

С «Р х100х05хС конце н тр ация субс трата; процент гидролиэа; время инкубации; концентрация белка. где С

t

AKTHBHQctb катепсина С определяют по формуле

FxC

Ас

1э1х х0,1хС где F интенсивность флюорвсценции анализируемого гомогената тромбоцитов; время инкубации; интенсивность флюоресценции стандартного раствора р-нафтиламина, концентрация стандартного раствора — нафтиламина ("Reana1", Вен грия), концентрация белка.

Fst

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в клинической практике для определения нарушения липидного обмена.

Цель изобретения — упрощение способа и повышение точности диагностики эа счет использования в качестве биологического материала тромбоцитов крови и определения активности катепсина С и фосфолипазы A, .

1О

Способ осуществляется следующим образом.

У больного отбирают кровь, центрифугируют ее с этилендиаминтетраацетатом натрия (ЭДТА). Отделяют плазму, 15 из которой после центрифугирования с фиколом выделяют тромбоциты. Выделенные тромбоциты осаждают цинтрифугированием, промывают, гомогениэируют в растворе сахароэы и ЭЛТА. Гомогенат 20 делят на две части, к одной иэ которых добавляют С вЂ” лецитин, а к друго и — гл ицип-L-фе н ил ап ан ин- р-н афтиламид. Образцы инкубируют в течение

30 мин при 37 С и радиометрически на сцинцилляционном счетчике определяют активность продуктов гидролиэа фосфолипазы А, а продукт гидролиэа катепсина С вЂ” свободный р -нафтиламин определяют спектрофлюориметрически при 30 волне возбуждения 336 нм и волне испускания 414 нм.

Активность ферментов выражают в наномолях субстрата, гидролизованного за мин 1 мг белка.

Получают количество фосфолипазы

А<, в норме равное 0 57 +. О 07, а катепсина С 1,68 + 0,27 нмоль/мин/мг белка.

При увеличении этих значений для катепсина С и фосфолипазы А выше

2, 5 и 1, 2 нмоль/мин/мг белка диагно— стируют нарушение липидного обмена.

П р им е р 1. У пациента В., 27 лет, с нормальной массой тела, без клинических признаков ишемической болезни сердца (ИБС) отбирали 10 мл крови в пробирку, содержащую 1,0 мл

ЭДТА, и центрифугировали 20 мин на центрифуге при 150 r g. После центрифугирования отбирали надосадочную жидкость и наслаивали на 6%-ный раствор фиколла с 76% верографином, центрифугировали 20 мин при 300 х 8, отбирапи мутную полоску, содержащую тромбоциты, центрифугировали 30 мин при 1200 х g. Белый осадок тромбоцитов промывали в 3,0 мл 0,15 М трисНС1 буфере (рН 7,4) и центрифугировали 10 мин при 1200 х g. Полученный осадок гомогенизировали, используя в качестве суспендирующей среды 0,25 M раствор сахароэы с 0,001 M ЭДТА.

0,1 мл гомогената тромбоцитов инкубировали 30 мин при 37 С с 0,1 мл субстратно-буферного раствора (5 мМ гли-фен †А, 2 MM дитиотрентола, 4 мМ ЭДТА и 0 2% тритона Х-100 в

0,2 М растворе ацетатного буфера, рН 5,0), вносили i 8 мл глицил — ИаОН буфера, рН 10,4. Интенсивность флюоресценции определяли при волне возбуждения 336 нм и волне испускания

414 нм.

Активность катепсина С А „=

1,46 нмоль/мин/мг белка.

0,5 мл гомогената тромбоцитов ин,кубировали 30 мин при 37 С с

150 нмоль С вЂ” лецитина, 160 мкмоль ацетатного буфера, рН 4,5. Продукты гидролиэа разделяли с помощью тонкослойной хроматографии и измеряли их активность на сцинтилляционном счетчике, рассчитывали процент гидролиэа лизолицитина.

Активность фосфолипазы А, А =

0,59 нмоль/мин/мг белка.

Всего в контрольной группе было обследовано 8 человек. Среднестатистические цифры активности по группе составляли для катепсина С 1,68 +

1324637

+ 0,27, для фосфолипаэы А, 0,57 +

+ 0,07 нмоль/мин/мг белка.

Пример 2. У больного P., 34 лет, с ожирением II степени активность лизосомальных гидролаз в тромбоцитах определяли аналогично примеру 1.

Активность катепсина С А к = 3,20, а активность фосфолипазы A„ Aф = — 2,13 нмоль/мин/мг белка. 10

Всего было обследовано в этой группе 8 больных с ожирением. Средне,статистические цифры активности по группе составляли для катепсина С

3,68 + 0,53, для фосфолипаэы А 2,26+15

1 0,24 нмоль/мин/мг белка.

Пример 3. У больного К., 43 лет, с ИБС активность лиэосомальных гидролаз в тромбоцитах определяли .аналогично примеру 1. 20

Активность катепсина С А = 7,88, а активность фосфолипаэы А А

1 ф

1, 99 нмоль/мин/мг белка.

Всего в этой группе было обследовано 36 больных ИБС с нормальной мас- 25 сой тела и ожирением. Среднестатистические цифры активности по группе составляли для катепсина с 7,41 +

1,45, для фосфолипазы А„ 1,78 0,34 нмоль/минlмг белка. 30

Пример 4. У больного Д., 44 лет, с ИБС и ожирением I степени активность лизосомальных гидролаз в тромбоцитах определяли аналогично примеру 1, до и после проведения кур- 35 са диетотерапии.

Активность катепсина С до лечения

- Ак = 7,90, после лечения Al, =

3,91 нмоль/мин/мг бедка.

Активность фосфолипазы А до ле- 40

1 чения А ф = 1, 92, после лечения А, =

1,01 нмоль/мин/мг белка.

Всего в этой грулпе было обследовано 30 больных с ИБС и ожирением.

Среднестатистические цифры активности 45 по группе для катепсина С до лечения

7,69 Т 1,02, после лечения 3,87 +

+ 0,59 нмоль/мин/мг белка (р (0,01), для фосфолипазы А, до лечения 2, 13 «+

+ 0,25, после лечения 1,09 i 50

+ 0,14 нмоль/мин/мг белка (р (0,01).

Сводные данные 110 активности лизосомальных гидролаз в тромбоцитах 10 пациентов представлены в таблице.

Как видно иэ приведенных примеров, величина нормальных значений активности катепсина С и фосфолипазы А в .1 контрольной группе обследованньи: соответствовала 1,68 + 0,27 и 0,57 +

+ 0,07 HMoJlb/ìèí/ìã белка. У больных с нарушеным липидным обменом с клинической картиной ИБС и ожирением (n = 44) в тромбоцитах наблюдалось увеличение активности лиэосомальных катепсина С до 6,73 .й 1,49 (р (0,001) и фосфолипазы А до 1,87 «+

+ 0,41 (р < 0,01) нмоль/мин/мг белка.

Под влиянием лечения у больных ИБС и ожирением в тромбоцитах активность катепсина С снижалась с 7,69 1 1,02 до 3,87 T 0,59 (р (0,01), а фосфолипазы А, с 2 13 + 0 25 до 1,09 + О, 14 (р (0,01) нмоль/мин/мг белка, приближаясь к нормальным значениям. Курс диетотерапии проводили у 30 больных с нарушенным липидным обменом, у

9 из них активность лизосомальных гидролаз в тромбоцитах после лечения вернулась к норме.

Предлагаемый способ может служить контролем эффективности диеты при коррекции метаболических нарушений у больных ИБС и ожирением.

Формула изобретения

Способ, диагностики нарушения липидного обмена путем отбора биологического материала и определения в ней лизосомальных гидролаз, о т л и ч а— ю шийся тем, что, с целью упрощения способа и повьппения точности диагностики, в качестве биологического материала используют тромбоциты крови, определяют в них активность лиэосомальных катепсина С и фосфолипазы А„ и при значениях активности вьппе 2,5 и 1,2 нмоль/мин/мг белка соответственно диагносцируют нарушение липидного обмена.

1324637

Активность, нмоль/мин/Ml" белка

Пациент фосфолилазы

А1 кате псина

0,57 + 0,07 (норма) 1,68 + 0,27 (норма) Нет нарушения липидного обмена

0,66

2,13

+,Диагностика затруднена

0,89

2,31

То же

1,18

2,37

2,54

1,25

1,42

2,87

То же

2,98

1,50

3,23

1,92

2,62

3,85

4,15

3,64

4,66

3,68

Составитель H. Гуляева

Техред Л.Сердюкова

Корректор N. Пожо

Редактор О.Головач

Заказ 2986/2

Поди исное

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Степень выр аженности изменений

Тираж 595

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Оценка изменений активности ферментов

Диагносцируется нарушение липидного обмена