Штамм культивируемых клеток мака papaver sомnifеruм, используемый для получения алкалоидов

 

Изобретение относится к биотехнологии и может Выть использовано в медицинской промьгашенности для получения биологически-активных веществ. Целью изобретения является получение штамма культивируемых клеток мака Papaver somniferum продуцирующего алкалоиды . Штамм Papaver somniferinn PS 5 получен в Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева и хранится в специализированной коллекш культивируемых клеток высших растений данного института под номером ВСКК (ВР) № 4. Биомасса штамма светло-кремового цвета состоит из клеток со средним диаметром T18,0±0,2(i . Штамм способен к росту на твердой (агаризованной) и в жидкой питательной среде. Суммарное содержание алкалоидов (в рд/г сухого вещества) при вьфащивании на агаризованной среде составляет 361, при этом в составе алкалоидов преобладает наркотин (194 ь/г сухого вещества). Суммарное содержание алкалоидов ()м/л питательной среды) при суспензионном культивировании штамма составляет 2830, на долю сангвинарина приходится 2450. 3 табл. О с

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИА ЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (111 (50 4 С 12 N 5/00, А 61 К 35/78

ОПИОАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMY СВИ4ЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (46) 23. 05.88. Бюл. М 19 (21) 4058481/31-13 (22) 17.04.86 (71) Институт физиологии растений им. К.А. Тимиряэева (72) P.Ã. Бутенко, 3,Б. Шамина, Л.В. Фролова, В.Н. Пауков, О.В, Решетняк и Л.К. Воспенникова (53) 578.085.23(088.8) (56) Forche Е., Frautz В. Saupvinarin und Protopinalkaloide in Papaversuspensions-kulturen. Planta medica

1981 42, 2:137. (54) ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК МАКА

PAPA VER S0MNIFERUM, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ

ПОЛУЧЕНИЯ АЛКАЛОИДОВ (57) Изобретение относится к биотехнологии и мокет быть использовано в медицинской промышленносги для получения биологически-активных веществ.

Целью изобретения является получение штамма культивируемых клеток мака

Papaver somniferum продуцирующего алкалоиды. Штамм Рарачет somniferum PS 5 получен в Институте физиологии растений им. К.А. Тимиряэсв» и хранится в специализированной коллекции культивируемых клеток высших растений данного института под номером ВСКК (ВР)

Ф 4. Биомасса штамма светло-кремового цвета состоит иэ клеток со средним диаметром 118,0+0,2ш . Штамм способен к росту на твердой (агаризован" ной) и в жидкой питательной среде.

Суммарное содержание алкалоидов (в

p/r сухого вещества) при выращивании на агаризованной среде составляет

361, при этом в составе алкалоидов ф преобладает наркотин (194 в /г сухого вещества). Суммарное содер*ание алкалоидов (1к/л питательной среды) при суспензионном культивировании штамма составляет 2830, на долю сангвинарина приходится 2450. 3 табл.

I 347449

f1 (;>бр(т(!!1!(<> T!«>r (I Tr к б(1<>теx ff(>— л f f1lf и 11ож .т rflr1 исп(льэ(>влно в меgfff ffl! ff(f(F>ff 1>РОЛ((ППЧЕ!!11(>(ТИ ДПЯ ПОЛУ <Ев

НИ Я Г>И(ЛИГИ !P < КИ Я К ТИННЫХ ВЕЩЕСТВ, !

}елью и зоГ> ре те ни я я вля ется пол учение п(тлммя культ11нируе1<ых клеток мака

Рл}>л>(с r s(>mf> i f егцп>, продуцирующего морфиновы ялкялоилы и растущего клк в жидкой, тяк и ня твердой питательных средлх.

Штлмм Гa}>avpr s<>mn if prffm PS 5 пол уч(н в l l!f p титуте физиол<>1 ии растений им. К.Л. Тимирязева и хранится в Специялиэиро янной коллекции культивиРУЕМЫХ КЛЕтоК ВЫСП1ИХ РЯСтЕНИй ДаННОГО институтл под номером ВСКК(ВР) }(4 и хярлктеризуетс я следуюпв<ми признаками

Морфологические признаки. Биомасса светло-кремового цветя cncòîèò из ( клеток сп срелним диаметром 118,0+

1O,2!ff, пределы варьирования 60-530lff, Штамм представлен двумя типами клеток клетки м(ристемятического типа округлые, реже вытянутые, ядра ffpaнильных очертаний, интенсивно окрапгивлютс, ядрьппки (одно или два) не всегдя вырлжеиы, густая цитоллазма содержит зерна крахмала; клетки плренхимного типа — более крупных рлэмероя, с меньшим ядерноплязм(иным < тнопн ffffpf4, стенки утолщены, рыхлая цитоп паз ил содержит большую вакуоль. физиологические признаки. Биомасса способнл к ро<.ту на твердой (лгаризовлнной) и ff жидкой среде. }1ри поверхностном нырящивлнии индеfFr роста за

21 сут. выращивания rостлвляет 8-!2 (по сырой массе), при этом штамм продуцирует ллкялоиди: нлркотин, кодеин, морфин, плпянериц. Преобладает наркотин. При глуГ>инном выращивании индекс роста зл 12 сут. выращивания составляе г 13-17 (flF> числу клеток), при этом штамм продуцирует алкялоиды: кодеин, прс тонин, слнгвинярин. Около

907. ллколоидон выделяются в среду.

Митотический индекс в суспенэионной культуре достигяет мяк(-имума на

1Π— 12 сут. и в, разных пассажах может кол< баться от 1, 5 до 5, 57.. (!Испо живых клеток 787..

Использование штамма PS 5 иллюстрируется следующими примерами

ll р и и е р 1. Клллусняя масса

РБ 5 вь(лживяется стерильно из расчета 30 г сырой мя -сы ткяни ня 1 л (1>pfff f нл PT(. 1>их>ь1(ую ягяриэ(>ванную иитлтел1,ffyf(> среду, ря«литую по 20 и

80 ил в биологические проГирки и к<лбы нл 250 ил, Среда имеет следукхпий состав, г/л:

}(}}1, }}О 1145-1850

KN0f 1490-2 !00

СлС1, 2Н,О 420-500

М> SO 7Н гО 350-40О

1О КН2 РО 150-210

Н1В01 4, 2-8,0

МБО4 4Н О 15,6-26,7

2пSO 7Н О 6,0-10,30

KJ О, 53-0,90 ! Б }>}а 2 МоОф 2Н О 0,15-0,30

С(.1804 5Н10 0,03-0,075

СОС12 6Н,О 0,03-0 075

ЕеБО4 7Н О 25,00-30,00

NR эдтл 26, 10-40, 10 пиридоксин 0,5-1,0; никотиновая кислота 0,5-1,0; тиамин 0,05-0 15 инозит

80-120; гидролизат казеина 800-1200;

2,4-I} 0,05-0, 15; кинетин 0,05-0, 15;

ДЭДТК 4-5; сахароза 2-5; агар-агар

25 пллстинчатый отечественный 0,6-0,8Х. рН среды 5,6-5,8. о

Ь

Штамм выращивают при 26+1 С в темноте, при влажности 674 37. Продолжи30 тельность цикла ныращивания составляет 2! сут °, по истечении этого срока биомасса увеличивается по сырой массе в среднем в 8-12 раз. Ее отделяют от среды и для последующего определения

35 содержания ллкалоидов высушивают пои комнатной температуре.

С целью качестненного и количественного определения содержания алка4о поидов, образуемых штаммом РБ 5, используют комбинацию тонкослойной и гаэожидкостной хроматографии. Анализ алкалоидной фракции проводят следующим образом. Точную навеску воздушно45 сухой массы (1,5-2,0 г) трижды Экстрагируют смесью хлороформ-изопропанолэтанол-аммиак (6:2:},5:0,5). Объединенные экстракты упаривают досуха, сухой остаток растворяют в диэтиловом

Бп эфире и экстрлгируют 27.-ным раствором

НzSO> Кислую фракцию подщелачивают

}(}а СО, до рН 9,0. Операцию повторяют и свободные оснонания алкалоидов экстрагируют смесью хлористый иетилен-. 5 метанол (3:1), уплринают, затем сухой остаток растворяют в смеси хлороформа с изопропанолои (3:1) и анализир у> >т. Результаты анализа предс та вле ны в табл. 1.

1347449

Таблп.га1

10,0 коннентриропа«як<к< рост«< р< м аммиака при персмошивании и и«< т пь<пающе экстрагируют смесью хлороформ:ме5 иманол (4:1).

Объединенные хлороформно-метанольные экстракты упарипают досуха под о вакуумом при 40-50 С, добавляют определенное количество внутреннего стан1ð дарта (гексадека 1,12-диода) в хлороформе-изопропаноле (3:1) и анализируют с помощью гаэожидкогтной и тонкослойной хроматографии.

Результаты представлены в табл. 2.

Таблица2

Алкалоиды р /г сухого вещества

9,2

Кодеин

Морфин

Папаверин

Наркотин

E. алкалоидов

26,0

194

53,7

361

Алкалоиды

Пример 2. Лля получения суспензионной культуры штамма PS 5 10 мл 20 клеточной суспензии плотностью 5-6

«10 кл/мл добавляют в 50 мл среды

5 следующего состава, г/л:

НН 4 НО 750-900

KNO, 900-1000 25

СаС12 2Н О 180-260

МВ50 7Н 135-235

КН Щ 60-110

H i8O 2,5-3,7

Мп SO 4Н О !0,0-!3,0

Еп504 7Н О 3,5-5,1

KJ 0,3-0,5

Na МоО, 2Н,О 0,05-0,20

CuSOq 5Н О 0 005-0,05

СоС1 6Н О 0,005-0 05

FeSO4 ° 7Н,О 13,0-15,0

Na ЭЛТА 17,0-19,5 пиридоксин 0,5-16; никотиновая кислота 0,5-1,0; тиамин 0,05-0,15; иноэит

80-120; гидролизат каэеина 800-1200; 40

2,4-Л 0,05-0, 5; ЛЭЛТК 4,0-5,0; сахароза 2-5. рН среды 5,6-5,8. о

Выращивание проводят при 26 С в темноте, при влажности 67+37, цикл выращивания составляет 12-14 суток, 45 биомасса штамма эа этот период увеличивается в среднем в 15 раз.

Затем биомассу отделяют от питательной среды фильтрованием на бумаге, высушивают при комнатной температуре с применением вакуума. Точную навеску (1 — 1,5 г) воздушно-сухой измельченной ткани экстрагируют при комнатной температуре и перемешивании в 157-ной уксусной кислоте (1:50 мас./объем).

Экстракцию повторяют дважды в течение

30 и 60 мин. К объединенному фильтрату добавляют смесь хлороформ:метанол (4:1), рН волной фазы доводят до 9,5г/г сухого вещества

0,38

Кодеин

Протопин

Сангвинарин

42,22

Следы

Сумма алкалои42,60 дов

Таблица 3

Кодеин

Сангвинарин

Протопин

2450

290

Сумма алкалоидов

2830

Содержание алкалоидов

Содержание алка <оидов

В 50 мл среды, свободной от клеток, доводят до рН до 1,8-2,7 с помощью

972-ной уксусной кислоты и перемешивают в течение 1,5 ч затем проводят нейтрализацию концентрированным ам миаком до рН 9-9,5 и исчерпь<нающую экстракцию смесью хлороформ — метанол (4:1) и анализируют с помощью гаэожидкостной и тонкослойной хроматографии. Результаты представлены в табл.3.

Алкалоиды Содержание алкалоидов, р г/л

Формула и з о 6 р е т е н и я

Штамм культивируемых клеток мака

Рарачег somniferum ВСКК(ВР) т 4 (Специализированная коллекция культивиру! 347449

Составитель M. Серова

Техред М.Дидык КорректорГ. Реветник

Редактор Л. Лашкова

Тиразк 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Иосква, 3-3$, Рауиская наб., д. 4/5

Заказ 3385

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Уигород, ул. Проектная, 4 емых клеток высших растений Институэа физиологии растений им. К.Л. Тнмирязева АН СССР), испольауемый для получения алкалоидов.