Способ определения пептидов в напитках

 

Изобретение относится к пищевой промышленности. Способ сокращает длительность анализа и расход химических реактивов и материалов, а также повышает точность анализа. Согласно способу 15 мл исследуемого напитка , доведенного до нейтральной среды (рН 7), пропускают через стеклянную колонку размером (1,0 х X 20 см), заполненную ионообменной смолой КРС-2П в водородной форме, со скоростью 1,5 мл/мин. После промывания смолы дистиллированной водой в количестве 15 мл проводят элюирование пептидов 30 мл 10%-ного раствора аммиака со скоростью 2,0 мл/мин. 4,0 мЛ полученного злюата, имеющего рН среды 12,5, наливают в мерную колбу емкостью 25 мл, добавляют 0,5 мл 0,1 н. раствора метилглиоксаля, смесь выдерживают 30 мин при комнатной температуре (18-20 С), приливают 1 н. раствор соляной кислоты с таким расчетом , чтобы рН среды стала равной 3,0-3,2, В колбу добавляют дистиллированную воду до метки и тщательно перемешивают, после чего проводят спектрофотометрирование продуктов реакции при 335 нм, Содержание пептидов определяют по калибровочной кривой . 1 ил,, 2 табл. сл оо О) Од СО 4 оо

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5l)4 G 01 N 33/14

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

Н А BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (2!) 4103570/30-13 (22) 28.07.86 (46) 15.01.88. Бюл. Ф 2 (71) Всесоюзный научно"исследовательский институт винограда и продуктов его переработки "Магарач" (72) Г. Г. Валуйко, В. С ° Разуваев, Г, Н. Арпентин и 3. Ю. Бажаев (53) 663.479(088.8) (56) Petershater G. Prey V, Eine

photometrische Methode zur analytischen. Bestimmung von Peptiden neben

Aminosan reu. — Aucrochimica Acta, 1969, N - 5, s 981-988.

Авторское свидетельство СССР

N - 630582, кл, G 01 N 33/14, 1978. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕПТИДОВ

В НАПИТКАХ (57) Изобретение относится к пищевой промышленности. Способ сокращает длительность анализа и расход химических реактивов и материалов, а также повышает точность анализа, Согласно способу 15 мл исследуемого на„„SU„„1366943 А 1 питка, доведенного до нейтральной среды (рН 7), пропускают через стеклянную колонку размером (1,0 х х 20 см), заполненную ионообменной смолой КРС-2П в водородной форме, со скоростью 1,5 мл/мин, После промывания смолы дистиллированной водой в количестве 15 мл проводят элюирова" ние пептидов 30 мл IOX-ного раствора аммиака со скоростью 2,0 мл/мин.

4,0 мй полученного элюата, имеющего рН среды 12,5, наливают в мерную колбу емкостью 25 мл, добавляют 0,5 мл

0,1 н. раствора метилглиоксаля, смесь выдерживают 30 мин при комнатной темо пературе (18-20 С), приливают 1 н, раствор соляной кислоты с таким рас" четом, чтобы рН среды стала равной

3,0-3,2. В колбу добавляют дистиллированную воду до метки и тщательно перемешивают, после чего проводят слектрофотометрирование продуктов реакции при 335 им ° Содержание пепти" дов определяют по калибровочной кри" вой. 1 ил., 2 табл.

Мг ш . и.NN

1 М

Г (2) 1

136694

Изобретение относится к пищевой промышленности, в частности к способам определения пептидов в напитках, и может применяться в консервной, пи5 вобезалкогольной, винодельческой промышленности.

Целью изобретения является повышение точности анализа, сокращение его длительности и снижение расходов реактивов и материалов.

Способ осуществляют следующим .образом, 10-20 мл напитка наливают в химический стакан емкостью 50 мл, добавляют щелочь до получения рН среды 7,0 (0,5-1,2 мл 1 н, щелочи) и пропускают через стеклянную колонку (размером l Îõ20 см), заполненную ионообменной смолой КРС-2П в водород- 20 ной форме, со скоростью 1,5 мл/мин.

Ионообменная смола KPC-2П вЂ” продукт сополимеризации стирола и дивинилбензола (ДВБ) — характеризуется низким процентом сшитости (2 ДВБ). Пептиды 25 задерживаются на смоле вследствие ионообмеиа и сил адсорбции. Большинство веществ, искажающих результат анализа (белки, фенольные соединения, соли, сахара, органические кислоты), свободно проходят через колонку, и лишь незначительная часть примесей задерживается на смоле ° Для гарантированного смыва этой части примесей смолу промывают дистиллированной водой в объеме, равном объему исходной

35 пробы (10-20 мл) . После промывания смолы проводят элюирование пептидов

10%-ным раствором аммиака со скогостью 2,0 мл/мин. 1О -ный раствор 40 аммиака, имеющий рН среды 12,5 (элюент), берется в двухкратном избытке по отношению к объему исходной пробы для обеспечения полной элюации пептидов из смолы, Так как количество пептидов и аминокислот в полученном элюате весьма незначительно по сравнению с объемом элюента, то рН среды последнего практически не изменяется и остается равным 12,5, Для проверки полноты элюирования пептидов и аминокислот со смолой 1,02,0 мл элюата наливают в мерную колбу емкостью 25 мл и добавляют 0,5 мл

О, 1 н ° раствора метилглиоксаля, Такого

55 количества раствора метилглиоксаля с избытком достаточно для полного взаимодействия с содержашимися в элюате пептидами, в результате чего

3 2 образуется продукт> имеющий максимум поглощения при Л =335 нм, Смесь выдерживают ЗО мин при комнатной температуре (!8-20 С), Затем в колбу приливают 1 н, раствор соляной кислоты до получения рН среды 3,03,2. В колбу добавляют дистиллированную воду до метки 25 мл и тщательно перемешивают. Полученный раствор наливают в кювету слоем толщиной

1 см, после чего измеряют оптическую плотность при 3 =335 нм. Если оптическая плотность 0 ) 1,2 и зависимость

D = f (С) выходит за пределы линей". ного участка калибровочной кривой (см. чертеж), то исследуемая проба черезмерно концентрирована, анализ после ее соответствующего разбавления повторяют, По калибровочной кривой (фиг. 1) при оптической плотности

D находят концентрацию пептидов С (мМоль/л). Полученные данные С пересчитывают по формуле где m — концентрация пептидов в мг/л;

К вЂ” коэффициент разбавления;

С вЂ” концентрация пептидов, мМоль/л;

М вЂ” молекулярная масса трипептида глицил-глицил-глицин, равная 189 г/моль.

Для сравнения результатов анализа с аналогами концентрацию пептидов выражают в мг азота пептида на литр (мг N пеп/л) по зависимости: где m „— концентрация пептидов, мг N пеп/л;

М вЂ” молекулярная масса азота, равная 14; п — число атомов азота входящих в состав пептида (для глицил-глицил-глицина и=З).

Общая продолжительность анализа составляет 65 мин, Пример 1, 15 мл яблочного сока наливают в.химический стакан емкостью 50 мл, добавляют едкий натрий до получения рН среды 7,0 (1,2 мл 1 í. Na0H) и пропускают через стеклянную колонку (размером

1,0 х 20 см), заполненную ионообменной смолой KPC-2П в водородной форме, со скоростью 1,5 мл/мин. Далее про43

4 следуемого напитка по прототипу дал следующие результаты: 305 и 68 мг/л соответственно, Продолжительность анализа по прототипу 95 мин °

Пример 3 ° 10 мл пива наливают в химический стакан емкостью

20 мл, добавляют едкий натрий до получения рН среды 7,0 (0,5 мл 1 н.

МаОН) и пропускают через колонку (размером 1,0 х 20 c»), заполненную ионообменной смолой КРС-2П в водородной форме, со скоростью 1,5 мл/мин.

Далее промывают смолу Дистиллированной водой в количестве 10 мп. После этого проводят элюирование пепти- дов 20 мл 10%-ного аммиака со скоростью 2,0 мл/мин 1,0 мл элюата, имеющего рН среды 12,5, используют для проведения реакции с метилглиоксалем, после чего подвергают спектрофотометрическому анализу, как описано в примере 1, При оптической плотности

D = 0,870 концентрация пептидов равна 1658 мг/л, азот пептидов—

365 мг/л ° Общая продолжительность определения 65 мин, При проведении анализа напитка .по прототипу концентрация пептидов составила

1531 мг/л, а азот пептидов-340мг/л.

Общая продолжительность анализа по прототипу — 88 мин.

Пример 4. Сравнительный анализ точности двух методов определения пептидов проводят на яблочном соке и столовом вине. Предвари тельно в каждом из исследуемых напитков определяют концентрацию пептидов.

Из химически чистого препарата глицил-глицил-глицина готовят рабочий раствор с концентрацией 2000 мг/л.

Рабочий раствор пептида добавляют в каждый из напитков из расчета

100 мг/л. B последующем проводят определение суммарного содержания пептидов так, как описано в прототипе и приведенных выше примерах. Критерием оценки точности методов служит процент определения добавленного пептида.

13669 мывают смолу дистиллированной водой в количестве 15 мл. После этого проводят элюирование пептидов 30 мл

10%-ного раствора аммиака (2-кратное разбавление) со скоростью.2,0 мл/мин.

Полученный элюат имеет рН среды 12,5.

В мерную колбу емкостью 25 мл наливают 2,0 мл элюата, добавляют 0 5 мл

0,1 н. раствора метилглиоксаля, смесь,0 выдерживают 30 мин при комнатной температуре (18-20 С). Затем в колбу приливают 1 н. раствор соляной кислоты до получения рН среды 3,0-3,2.

В колбу добавляют дистиллированную воду до метки 25 мл (12,5-кратное разбавление) и тщательно перемешивают. Полученный раствор наливают в кювету слоем толщиной 1 см, после чего на спектрофотометре СФ-4А изме20 ряют оптическую плотность при

335 нм. По калибровочной кривой при оптической плотности D = 0,850 концентрация пептидов С равна мМоль 25

0,172 †- †; так как коэффициент разбавления К = 25, то m = 812 мг/л (по формуле 1), а азот пепетидов

m,= 178 мг/л (по формуле 2). Общая продолжительность анализа 75 мин. Зб

Параллельно проводят анализ исследуемого напитка по способу-прототипу, концентрация пептидов составляет 736 мг/л, а азот пептидов

164 мг/л, Продолжительность анализа по прототипу — 102 мин.

Пример 2. 20 мл вина наливают в химический стакан емкостью 50 мл, . добавляют едкий натрий до получения рН среды 7,0 (!,2 мл 1 í. NaOH) и

40 пропускают через стеклянную колонку (размером 1,0 х 2 0 см), заполненную ионообменной смолой КРС-2П в водородной форме, со скоростью

1,5 мл/мин. Далее промывают смолу

45 дистиллированной водой в количестве

20 мл, После этого проводят элюирование пептидов 40 мл 10%-ного раство- ра аМмиака со скоростью 2,0 мл/мин..

2,0 мл злюата,, имеющего рН среды 12,5, используют для проведения ре,акции с метилглиоксалем, после чего

1 подвергают спектрофотометрическому анализу, как описано в примере 1.

По калибровочной кривой при оптической плотности D = 0,360 находят кон55 центрацию пептидов — 349 г/л, азот пептидов — 77 мг/л. Общая продолжительность анализа 80 мин. Анализ исРезультаты определения и математической обработки приведены в табл. 1, из которой следует, что более высокая точность достигается по предлагаемому способу (% определения пептидов по предлагаемому способу составил 99,2 и 98,8, а в прототипе — 97,4 и 91,7 соответственно).

5 1366943 е

Технико-экономическая эффектив- отличающийся тем, что, ность предлагаемого способа дости- с целью повыщения точности анализа, гается сокращением продолжительно- сокращения его длительности и сни" сти анализа и расхода химических ре-. жения расхода реактивов и материаактивов и материалов (табл. 2).

5 лов, щелочь вводят в пробу до.обеспечения рН 7,0, после чего выделяют

Ф о р м у л а и э о б р е т е н и я пептиды из пробы путем пропускания

Способ определения пептидов в ее через ионообменную смолу KPC-2П в напитках, предусматривающий отбор >0 водородной форме, промывают смолу пробы, введение в нее щелочи, доведе- дистиллированной водой и элюируют ние рН раствора до 12,5, внесение пептиды, при этом доведение рН метилглиоксаля, выдержку, спектрофо- раствора до !2,5 осуществляют в протометрирование продуктов реакции и цессе элюирования пептидов IOX-ным ., установление концентрации пептидов, раствором аммиака.

Таблица 1

Способ-прототип

Предлагаемый способ

Напито

Исходное

7 опре делени пептид

Найдено гли»

Добавлено

Исходное соДобавлено

Найопреления птида дено глицил глицил глицина, мг/л держание пеп глицилглицилглицина, мг/л цилглицилглицина, мг/л содержание глицил» глицил» глицина, мг/л пепти" тндов, мг/л

Овь г/л

Яблочный сок

812 97,4 812

736

100

100

909

99,2

821

901

818

904

806

905

Столовое вино

444 98,8

305

100

367 91,7

349

100

370

444

375

441

374

446

1366943

Таблица 2

Способ прототип предлагаемый

95 за, мин

Стоимость расходуемых реактивов и матерна" лов, коп

3,312

5,994

0,246

0,018

Соляная кислота 0,010

0,040

Аммиак

2,880

1,600

1,200

Пиво

Наименование показателей

Продолжительность анали"

В том числе:

Ацетат свинца

Гидроксид натрия

Метилглиоксаль

Смола KPC-2П

Столовое вино

Яблочный сок

0i010

0i010

0,040

0,600

0,012

1,440

0,600

0,600

1366943

r.z

1 дЮ ч

Ю

07Р

Кцнцентрсция лел сЫ С (-

Составитель Л. Пашинина

Редактор А. Маковская Техред М.Дидык

Корректор А. Обручар

Заказ 6834/44 Тираж 847

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4