Способ определения энтеротоксина энтеробактерий в биологическом материале

 

Изобретение относится к медицине. Цель изобретения - повышение точности способа путем выявления локализации термолабильного энтеротоксина. Для этого готовят гистологические срезы, затем инкубируют их с фракцией иммуноглобулинов Igg антиэнтеротоксической сьшоротки, соединенной с пероксидазой хрена, после чего наносят диаминобензидин, контрастируют четырехокисью осмия. Энтеротоксин фиксируют в местах появления окрашивания. Антиген, термолабильньш энтеротоксин энтеробактерий, выявляется на срезах бурыми гранулами и пятнами различной величины. § (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„1388422 A 1 (511 4 С 12 N 1/00» (т 01 N 33/48

» i$

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4175590/28-14 (22) 19. 01. 87 (46) 15.04.88. Бюл. 11» 14 . (7 1) Научно-исследовательский институт морфологии человека АМН СССР и Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии .им. Н.Ф.Гамалеи (72) Ю.Г.Пархоменко, И.Н,Емельяненко, Т.В.Диатроптова и Ф,С, Флуер (53) 6 15,475 (088. 8) (56) Шур И,В. Заболевания сальмонеллезной этиологии. М.:Медицина, 1970, с.188-192. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭНТЕРОТОКСИНА

ЗНТЕРОБАКТЕРИИ В БИОЛОГИЧЕСКОМ NATEРИАЛЕ (57) Изобретение относится к медицине.

Цель изобретения — повышение точности способа путем выявления локализации термолабильного энтеротоксина. Для этого готовят гистологические срезы, затем инкубируют их с фракцией иммуноглобулинов Igg антиэнтеротоксической сыворотки, соединенной с пероксидазой хрена, после чего наносят диаминобензидин, контрастируют четырехокисью осмия. Энтеротоксин фиксируют в местах появления окрашивания.

Антиген, термолабильный энтеротоксии энтеробактерий, выявляется на срезах бурыми гранулами и пятнами различной величины.

1388422

Изобретение относится к медицине.

Цель изобретения — повышение точности способа за счет выявления локализации термолабильного энтеротоксина. 5

Способ осуществляют следующим образом.

Органы, предназначенные для исиследования, режут на кусочки не более 0 5 см и опускают их на 1 ч э в спирт 96 при 4 С. Затем кусочки извлекают и режут острой бритвой на . кусочки не более 0,3 мм толщиной и снова опускают для дофиксации во вторую порцию спирта 96 на 24 ч 15 при 4 С. Далее их проводят по 1 ч о через 2 порции спирта 96 и через

2 порции спирта 100 при 4 С. Затем ткань обрабатывают 2 порциями ксио лола по 20 мин каждой при 4 С. После 20 этого следует проводка по 1 ч в 3 порциях парафина при 56-58 С. Затем кусочки заключают в парафин. Приготовленные парафиновые блоки хранят о при 4 С. Перед исследованием на тер- 25 молабильный энтеротоксин из парафиновых блоков готовят срезы толщиной

3-5 мкм. Непосредственно перед окраской срезы депарафинируют при комнатной температуре, для чего их 30 опускают последовательно в стаканчики с двумя порциями ксилола, затем в спирт-ксилол в соотношении 1:1 на

15 — 20 мин в каждом стаканчике.

Затем проводят по спиртам 100, 96, о

70, 50 по 5 мин в каждом и через

4 порции фосфатно-буферной смеси с рН 7,2-7,4 по 5 мин в каждой порции.

Перед началом окраски стекла опускают на 5- 10 мин в фосфатно-солевой буфер 4р с рН 7,2-7,4 при комнатной температуре.

После депарафинирования для связывания энедогенной пероксидазы сре- зы помещают на 30 мин в раствор перо- 45 ксидазы хрена, приготовленный из расчета 15 мг препарата на 10 мл фосфатно-буферной смеси при рН 7,27,4, После трехфазного отмывания в фосфатном буфере срезы обрабатывают перекисью водорода на метаноле в соотношении 1:99 в течение 10 мин.

После очередного трехкратного отмывания в фосфатном буфере на испытуемые срезы наносят конъюгат, представляющий собой фракцию иммуноглобулинов иммунной сыворотки кролика против термолабильного энтеротоксина кишечных палочек, соединенную с пероксидазой хрена. Конъюгат используют в рабочем разведении 1:100 в фосфатном буфере. Контакт осуществляют в течение 60 мин на водяной бане при комнатной температуре. После т рехкратного отмывания в фосфатном буфере на срезы наносят свежеприготовленный субстрат. Спустя 5 мин срезы отмывают от субстрата дистиллирован-ной водой и контрастируют 0,2-ным раствором четырехокиси осмия под контролем микроскопа. Срезы можно докрасить гематоксилином. Антиген, термолабильный энтеротоксин энтеробактерий, выявляется на срезах в виде бурых гранул и пятен различного размера.

Способ подтверждается примером, Пример, Мышей в возрасте

2-2,5 мес заражают перорально суточной культурой кишечной палочки штамма Н-10407. В различные сроки после заражения (3,6,8,14, 18 и 24 ч) их умерщвляют, берут кусочки тканей из тощей, подвздошной и прямой кишки, фиксируют в нейтральном формалине и заливают в парафин, как описано вьш;е. После контакта исследуемой ткани с фракцией иммуноглобулинов Igg иммунной сыворотки кролика против ! / термолабильного энтеротоксина кишечной папочки, соединенной с пероксидазой хрена, и контрастирования

0,2Х-ным раствором четырехокиси осмия в исследуемых срезах выявляют антиген, термолабильный энтеротоксин кишечной палочки. Он локализовался на поверхности ворсинок, Способ позволяет определить точную локализацию энтеротоксина энтеробактерий. формула изобретения .Способ определения энтеротоксина энтеробактерий в биологическом материале, отличающийся тем, что, с целью повышения точности за счет выявления локализации термопабильного знтеротоксина, готовят гистологические срезы, инкубируют с фракцией иммуноглобулинов Igg антиэнтеротоксической сыворотки, соединенной с пероксидазой хрена, после чего наносят диаминобензидин, контрастируют четырехокисью осмия и определяют энтеротоксин в местах появления окрашивания,