Способ получения фосфоэстераз гриба реniсilliuм вrеvi- сомрастuм

 

Изобретение относится к микробиологической промьштенности, в частности к способу получения фосфоэстераз (кислых фосфомоноэстераз ФМЭ-1 и ФМЭ-11, кислой и щелочной рибонуклеаз) гриба, используемых в исследовательской биохимической практике, в медицине и пищевой промыщленности. С целью более полного использования сырья за счет одновременного выделения кислой и щелочной рибонуклеаз, ФМЭ-1 и ФМЭ-11 фильтрат культуральной жидкости с анионообменного волокна ЦМ-А2, содержащий фосфомоноэстеразы, концентрируют ультрафильтрацией, подвергают гель-фильтрации на сефадексе G-100 с последующим диализом активных фракций, при хроматографии на КМ-целлюлозе разделяют фракции, содержащие ФМЭ-1, которая выходит в свободном объеме колонки, и фракции, содержащие ФМЭ-11, элюируемую тем же буфером с возрастающей до 0,6 М концентрацией раствора хлористого нат- . рия; последующее концентрирование ультр афильтрацией осуществляют раздельно для ФМЭ-1 и (ШЭ-11, затем раствор ФМЭ-1 подвергают лиофильной сущке, а раствор ФМЭ-П замораживают. S9 (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCKOIVIY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ВВ4ду»

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4149785/31-13 (22) 21.11..86 (46) 15.06.88. Бюл. У 22 (71) Институт биохймии и физиологии микроорганизмов АН СССР (72) В.А. Ежов, Н.И. Санцевич, И.E Лузина, А.Г. Трушкина и В.М.Николаева (53) 577.15(088.8) (56) Ильина Т.В., Безбородова С.И.

Внеклеточные фосфомоноэстераэы грибов рода Penicillium. — Микробиология, 1973, т.. XL)l; с. 1001.

Авторское свидетельство СССР

)I 734261, кл. С 12 N 9/22, 1977. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФОЭСТЕРАЗ

ГРИБА PENICILLIUM BREVE-COMPACTUM (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу получения фосфоэстераз (кислых фосфомоноэстераз ФМЭ-1 и ФМЭ-11, кислой и щелочной рибонуклеаз) гриба, используемых в исследова„„SU„„1402619 (51)4 С 12 N 9/16//(С )2 N 9/)6, С 12 R ):8)) тельской биохимической практике, в медицине и пищевой промышленности. С целью более полного использования сырья за счет одновременного выделения кислой и щелочной рибонуклеаз, ФМЭ-1 и ФМЭ-11 фильтрат культуральной жидкости с анионообменного волокна

ЦМ-А2, содержащий фосфомоноэстеразы, концентрируют ультрафильтрацией, подвергают гель-фильтрации на сефадексе

G-100 с последующим диализом активных фракций, при хроматографии на

КМ-целлюлозе разделяют фракции, со-. держащие ФМЭ-1, которая выходит в свободном объеме колонки, и фракции, содержащие ФМЭ-)1, элюируемую тем же буфером с возрастающей до 0,6 M концентрацией раствора хлористого натрия; последующее концентрирование ультрафильтрацией осуществляют раздельно для ФМЭ-1 и ФМЭ-11, затем раствор ФМЭ-1 подвергают лиофильной сушке, а раствор ФМЭ-11 замораживают.

1402619

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу получения фосфоэстераз (кислых фосфомоноэстераз ФМЭ-1 и

ФМЭ-II, КФЗ 3.1.3.2, кислой и щелочной рибонуклеаз — КФ.3 ° 1.4.2.2 и

3.1.4.2.3) гриба Penicillium brevicompactum, используемых в исследовательской биохимической практике и в медицине.

Цель изобретения — более полное использование сырья за счет одновременного выделейия кислой и щелочной рибонуклеаз и фосфомоноэстераз 15 и II.

Способ заключается в том, что по" лученный в ходе ферментации фильтрат культуральной жидкости гриба Penicillium brevi-compactum BKM F-2464D под- 20 вергают ионообменной хроматографии последовательно на анионите ЭДЭ-IОП и анионообменном волокне ЦМ-А2, на котором сорбируются рибонуклеазы, а фосфомоноэстеразы выходят в свобод- 25 ном объеме. Десорбцию рибонуклеаз с волокна проводят трис-ацетатным буферным раствором с возрастающей от

0 до 0,6 M концентрацией хлористого иатрия. Активные фракции, содержащие 30 рибонуклеазы, нейтрализуют, концентСхема получения ферментов гриба

PeuiciIIiuu bcevi-ссарасьла ф

Культявироваяне гриба Peuicilliuu Ьгечф-сиирассии

Очистка натмвяого раствора на аниоиите ЭДЭ-!ОЛ

Нейтрализация алпатов 2 я.йаОН

Х атог афнп йа о НИ-А2

Несорбнровамнме на ДИ А2 волокне фосфоманозстеразм !

Кояцентрмрозаияе иа ультрафнльтрате с ненбрамой УАИ-!00 !

Лнал из

Гель-хронатаграфяя яе С-!00

Элюциа 0,02 трнс-НС1 рН 7,5

Лналнз

Хроматография иа KN-целлюлозе

Эгооцик 0,02 н. трнс-апет. буферан рй 4,Ь, далее гралментом О-О,Ь И в тон ме буфере

Концентрирование фИЭ-азм

II ма мембраяа YAN-!00

Эамораянваине

Каицентрироваяие

ЖЭ-взм 1 иа мембране УАИ-!00

Лнофильиая сумка

Эмоция РЙК-аз 0,5 И

НеС1 в О,! И ацетатион оуфере рН 5

Найтралнзацип 2 н. РвОН

Концентрация на ненОране УАН-!00 Хроматография на

1 KN-целлюлозе

Днализ

Эмоция граднентон от О до M НаС1 в 0,0! таис"ацетатнан буфере рН 4,5 l

Комцентрировамие на нембране У!0!-)00

Гель-хроматография на гмдрорипьтном геле

Элюцаа 0,05 И Элюция 0 05 И грнс-НС1 рН 7,5 трис-НС1 рН 7,5

КаицеятрзоРОвв" Концентрирование мяа яислой мелочной РНК-азм

РНК"азм на нам нв .мембране УАИ-!00 бране УАИ-!00

Дна пи 9 upoTIQI Дналнз против 0,0! Н дмстнллмрааая- ацетатнага буфера ной вадя рН 3,3

1 I

Лиофилья а а Лмофильна а сумка

c Yue e кристаллов, вьюавиих при диализе рируют ультрафильтрацией и диализуют.

Проводят хроматографию на КМ-целлюлозе, концентрирование активных элюатов ультрафильтрацией и гель-хроматографию на гидрофильном геле ЭД-7,$, Разделенные при гель-хроматографии кислую и щелочную рибонуклеазы концентрируют ультрафильтрацией, диализуют. При диализе щелочной PHK-азы выпадают кристаллы. Отдиализованный раствор кислой PHK-азы и кристаллы щелочной PHK-азы лиофильно сушат.

Несорбированные на анионообменном волокне ЦМ-А2 фосфомоноэстеразы концентрируют ультрафильтрацией, диализуют и проводят гель-хроматографию на G-100 с целью очистки от примесных белков, мешающих разделению двух фосфомоноэстераз на ионообменнике

KM-целлюлозе. Активные фракции, содержащие фосфомоноэстеразы,.диализуют и подвергают хроматографии на KM-целлюлозе. Полученные ФМЭ-азу I u

ФМЭ-any II концентрируют ультрафильтрацией и,соответственно лиофильно сушат и замораживают, так как ФМЭ-asa II в процессе лиофильной сушки теряет активность.

Схема получения ферментов гриба

Penicillium brevi-compactum следующая

14026!9

0,2

Пример. Исходным посевиьгп материалом для получения внеклеточных фосфомоноэстераз служит культура

Penicillium brevi-compactum BKM

F-2464D, растущая на скошенном агаре.

Засев партий среды производят воцной суспензией конидий. Выращивание посевного материала в маточных колбах проводят на качалке, делающей !О

190 об/мин, при 24+1 С в течение 2024 ч на среде следующего состава, :

Глюкоза 5

Пептон 1

Аммоний серно- 15 кислый

Кальций хлористый 0,02

Мука соевая 0,5

Магний сернокислый 0,05

Вода дистиллированная До 1л

Полученную культуру в виде густой взвеси мицелия используют для засева питательной среды в ферментере. емкостью 30 л (полезная емкость до

20 л). Объем посевного мицелия для засева ферментера 1О от объема среды, возраст 24 ч. Для выращивания посев- 30 ного инокулята Penicillium brevi-compactum применяется среда того же состава, что и для проведения фермента— ции в колбах на качалке. Процесс выращивания посевного материала в ферментере проводят при следующем режиме: температура 24+1 С; расход воздуха 0,6:1 (л/мин по ротаметру); мешалка 200 об/мин; продолжительность

24 ч. 40

Полученную культуру в виде густой взвеси мицелия используют для засева питательной среды в ферментере емкостью 100 л (10 к объему засеваемой среды). Биосинтез фосфоэстераз Реп1ci11ium brevi-compactum проводится на среде такого же состава, что и для выращивания посевного материала в ферментере (емкостью 30 л) для выращивания инокулята. Ферментацию ведут

10 при следующих условиях: температура в ферментере 24+1 С; давление 0,20 3; расход воздуха 0 6:1 {л/мин по ротаметру); растворенный кислород поддерживается около 20 ; рН культу- .

5 ральной жидкости не ниже 3,0; продолжительность ферментаций 72 ч, По окончании ферментации судят по совокупности следующих показателей: повьппение рН культуральиой жидкости вьппе 3,0; активн< сть фосфоэстераз максимальная; полное исчерпание углеводов.

Ферментер охлаждают до 8 С, культуральную жидкость отфильтровывают, нативный раствор после фильтрации должен уцовлетворять слецуюшим гребоо ваниям: температура раствора 6-8 С; рН 3, 2-3, 6; прозрачный.

70 л нативного раствора пропускают через колонку с анионитом ЭДЭ-10П со скоростью !00 л/ч. Элюаты нейтрализуют 2 н. NaOH при перемешивании до рН 7,0-7,5 и подают на колонку с

ЦМ-А2 волокном со скоростью 100 л/ч.

На анионообменном волокне ПМ-А2 происходит сорбция РНК-аз, кислые фосфомоноэстеразы проходят через колонку.

Десорбцию РНК-аз ведут 0,5 N NaC1 в 0,1 н. ацетатном буфере, рН 5,0.

Собирают элюаты по 5 л и определяют активность PHK-аз. Активность ферментов определяют по интенсивности поглощения при 260 ммк кислорастворимых продуктов разрушения PHK после ее инкубации с раствором фермента. Актив— ные фракции (30 л) объединяют для дальнейшей очистки и нейтрализуют

2 н. NaOH до рН 6,8-7,2.

Фракции, содержащие фосфомонозстеразы (несвязавшиеся с ЦМ-А2 волокном), объемом 70 л подвергают дальнейшей очистке.

Выделение PHK-аз.

Активные фракции (30 л) после хроматографии на 1ь1-А2 волокне концентрируют ультрафильтрацией на пленке

УАМ-100 до объема 0,5 л и диализуют против 0,01 н. трис-ацетатного буфера. рН 4,5 (на 1 л концентрата берется

20 л диализующего раствора). Отдиализованный концентрат (0,7 л) наносят на колонку с КМ-целлюлозой (10 120 см) со скоростью 100 мл/ч, предварительно уравновешенную 0,01 н. трис-ацетатным буфером, рН 4,5. Элюцию ферментов с колонки ведут линейным градиентом концентрации NaC1 от О до 1 М, объединенные активные фракции (V

2,4 л) концентрируют ультрафильтрацией на мембране УАМ-100 до объема

30 мл и диализуют против 10 л 0,05 н. трис-НС1, рН 7,5. Отциализованный концентрат (40 мл) наносят на колонку с гицрофильным гелем ЭД-7,5 (10 150 см), уравновешенную 0,05 M трисНС1 буфером, рН 7,5.

140261

Активные фракции, содержащие кислую PHK-азу (1,2 л), концентрируют ультрафильтрацией до объема 50 мл, диализуют против дистиллированной

; воды, лиофильно сушат. Удельная активность кислой PHK-азы 500 ед/мг, выход 512.

Активные фракции, содержащие щелочную PHK-азу (1,2 л), концентрируют !О до объема 10 мп, диализуют против

0,01 н. ацетатного буфера, рН 3,5, .при этом щелочная PHK-аза кристаллизуется, кристаллы отделяют центрифу" гированием и лиофильно сушат. Удель- 15 ная активность щелочной PHK — азы

800 ед/мг, выход 377.

Выделение ФМЭ-аз. Фракции, несорбировавшиеся на

ЦМ-А2 волокне, содержащие кислые фос- 20 .фомоноэстеразы (70 л), концентрируют на ультрафильтрате с мембраной УАМ-100 до объема 170 мл и наносят на колонку с сефадексом G-100 (7,5н150 см), пред- варительно уравновешенну 0,02 н. трис- 25

ЯС1 буфером, рН 7,5. Хроматографио ведут тем же буфером со скоростью

100 мл/ч. Активные фракции, содержащие фосфомоноэстеразы (250 мл), диализуют против 5 л 0,02 н. трис-аце- . З0 татного буфера, рН 4,6 в течение 12 ч.

Отдиализованный раствор (270 мл) наносят со скоростью 100 мл/ч на колонку с КМ-целлюлозой (5 «100 см), предварительно уравновешенную 0,02 н. трис-ацетатным буфером; 4,6, колонку промывают 1,4 л 0,02 M трис-ацетатного буфера, рН 4,6, со скоростью

1.00 мл/ч, затем ведут элюцию раствором с линейным градиентом концентра- 40 ции NaC1 (0-0,6 м) в том же буфере (2,5 л) и с той же скоростью, ФМЭ-аза

I выходит с колонки со свободным объемом, а ФМЭ-аза II выходит при градиентной элюции. Фракции, содержащие 45

ФМЭ-азу I (560 мл) и ФМЗ-азу II ) (320 мл), концентрируют ультрафильтрацией на мембране УАМ-100 до 30 и

20 мл соответственно.

Концентрат ФМЗ-азы ? лиофильно су- 50 шат и получают 300 мг белого порошка с удельной активностью 800 ед/мг белка. Выход ФМЭ-азы I составляет 457. от общего содержания фосфомоноэстераз в культуральной жидкости. 55

Концентрат ФМЗ-азы II с удельной активностью 670 ед/мг белка замораживают и хранят при 20 С. Выход ФМЭ-азы

9 б составляет !07. от содержания фосфомоноэстераз в исходной культуральной жидкости.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать сразу четыре фермента из культуральной жидкости Penicillium brevi-compactum после одной ферментации, причем с сохранением высокого выхода и высокой удельной активности ФМЭ-аз по сравнению с указанными в известном способе.

Формула изобретения

Способ получения фосфоэстераз гриба Penicillium brevi-compactum ВКМ

F=2464D предусматривающий культивирование гриба анионообменную хроматографию культуральной жидкости последовательно на анионите ЭДЭ-!ОП и анионообменном волокне ЦМ-А2, десорбцию рибонуклеаз с волокна трис-ацетатным буферным раствором с возрастающей концентрацией NaC1, хромато- графию на гидрофильном геле с получением двух фракций,- концентрирование ультрафильтрацией после каждой стадии хроматографии, диализ и лиофильную сушку фракции, содержащей кислую рибонуклеазу, ультрафильтрацию фракции, содержащей щелочную рибонуклеазу, и последующую ее кристаллизацию диализом, отличающийся тем, что с целью более полного использования сырья за счет одновременного выделения кислой и щелочной рибонуклеаз и фосфомоноэстераз I и II, фильтрат культуральной жидкости с анионообменного волокна ЦМ-А2, содержащий кислые фосфомоноэстеразы, концентрируют ультрафильтрацией и подвергают хроматографии на сефадексе

G-100 с диализом активных фракций, при последующей хроматографии íà KMцеллюлозе разделяют фракции, содержащие фосфомоноэстеразу I которая выходит в свободном объеме колонки, и фракции, содержащие Фосфомоноэстеразу II, элюируемую линейным градиентом концентрации хлористого натрия до

0,6 М, последующее концентрирование ультрафильтрацией осуществляют раздельно для фосфомоноэстеразы I и фосфомоноэстеразы II, затем раствор фосфомоноэстеразы I подвергают лиофильной сушке, а раствор фосфомоноэстеразы II замораживают.