Способ получения ингибитора фермента превращения ангиотензина и штамм стрептомицета sтrертомyсеs снrомоfusсus nrrl 15098,используемый для его осуществления

 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается микробиологического способа получения ингибатора фермента превращения ангиотензина, относящегося к гипотоническим средствам . Цель изобретения - разработка способа получения гипотонического средства микробного происхождения и изыскание штамма-продуцента, пригодного для осуществления способа. В качестве продуцента используют штамм Stceptomyces chromofuscus NRRL 15098. Штамм выращивают в жидкой питательной среде, содержащей источники углерода и азота и минеральные соли, в глубинных условиях при аэрации, при 25-30 С и рН 7-8,3. Культуральную жидкость отфильтровывают и жидкую фракцию подвергают ионообменной хроматографии, в результате которой получают чистые факторы А, В и С. Эти факторы можно перевести в соответствунмцие соли и эфиры. Биологическое действие факторов и их производных аналогично. Для повышения выхода факторов А и В в питательную среду можно добавить лизин и/или проЛИН. 2 с. .и 4 з.п. ф-лы. i СО

СОЮЗ СОВЕТСНИХ соцИАлистичесних

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ, 7ф i

Щ Q»

К flATEHTY

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР пО делАм изОБРеТений и ОтнРцтий (21 ) 36352 70/28-13 (22) 15. 08. 83 (31) 409763; 409764; 409765 (32) 19.08.82 (33) US (46) 15. 06. 88. Бюл. У- 22 (71) Эли Лилли энд Компани (VS) (72) Ион Стюарт Миндерс (US), Син Кристофер О.Коннор (IE), Вальтер Мицуо Накацукаса (US) (53) 615.779,94(088.8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА ФЕРМЕНТА ПРЕВРАЩЕНИЯ АНГИОТЕНЗИНА И

ШТАММ СТРЕПТОМИЦЕТА $ТКЕРТОМУСЕЯ

CHR0M0FUSCUS NRRL 15098, .ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ

ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ (57) Изобретение относится к области биотехнологии и касается микробиоло-. гического способа получения ингибатора фермента превращения ангиотензина, относящегося к гипотоническим средст„,80„„3403991 А 3 (51)4 С 12 Р 17/10 // (С12 Р 17/10, С 12 R 1:465) вам. Цель изобретения — разработка способа получения гипотонического средства микробного происхождения и изыскание штамма-продуцента, пригодного для осуществления способа. В качестве продуцента используют штамм . Streptomyces ehromofuscus NRRL 15098.

Штамм выращивают в жидкой питательной среде, содержащей источники углерода и азота и минеральные соли, в глубинО ных условиях при аэрации, при 25-30 C и рН 7-8,3. Культуральную жидкость отфильтровывают и жидкую фракцию подвергают ионообменной хроматографии, в результате которой получают чистые факторы А, В и С. Эти факторы можно перевести в соответствующие соли и эфиры. Биологическое действие факторов и нх производных аналогично. Для повышения выхода факторов А и В в питательную среду можно добавить лизин и/или пролин. 2 с. и 4 з.п. ф-лы.

1403991

Изобретение относится к биотехнологии и касается микробиологического способа получения препарата медицинского назначения.

Цель изобретения — разработка способа получения гипотонического средства микробного происхождения и изыскание штамма-продуцента, пригодного для осуществления способа. ll0

Родственная культура, из которой выделен штамм Str. ehromofuscus, отобрана иэ почвенных образцов бразильской коллекции, Южная Америка. Хранится в Коллекции Культур сельскохозяйственного исследовательского Центра под номером NRRL 15098 и характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки. ,, Среда Характеристика роста 20

ISP В 2 Обильный рост, обильный (Междуна- воздушный мицелий: 2de . родная при- желтовато-серый (С у),, нятая среда субстратный мицелий: 69, выращивания глубокий ОУ, отсутствие 25

Streptomy- растворимого пигмейта сев)

ХЗР В 3 Хороший рост, субстратный

ISP В 4

ISP М 5

Агар Чапека

ТР0 (агар овсяной муки на томат ной пасте) мицелий:. 91d„gy, слабый рост воздушного мицелия, 30 отсутствие растворимого пигмента

Обильный рост, субстратный мицелий: 5б, глубокий

Br обильный воздушный мицелий: 2fe умеренно серый (6 у), отсутствие растворимого пигмента

Хороший рост, субстратный мицелий: 94, 1,01, Br, 40 хорошее развитие воздушного мицелия: 2dc желтовато-серый (С у), светложелтый растворимый пиг мент 45

Хороший рост, субстратный мицелий: 79.1 g у.у. Br, хорошее развитие воздушного мицелия: 3ge светложелтовато-серовато-корич50 невый (Gy), отсутствие растворимого пигмента;

Обильный рост, субстратный мицелий: 75, глубокий

yBr, обильный воздушный мицелий: Зяе светло-серовато-желтовато-коричневый (Gy), отсутствие .раство- " римого пигмента

Цифровые и буквенные обозначения, используемые для цветов субстратного мицелия, относятся к цветовым диаграммам стандартного образца центроидной цветовой диаграммы ZSCC-NBC, 9 2106 США, Коммерческое отделение, Национальное бюро стандартов.

Штамм S. сЬгошоГивсus продуцирует хорошо развитый нефрагмейтированный мицелий, который является моноподиально разветвленным. Спорофоры на воздушных гифах с образованием спиралей по 4-5 витков. Некоторые спирали образуют очень плотные шары по концам спорофары. Эти шары могут быть ошибочно приняты за склероции. Споры продолговатые с заостренной поверхностью, Фиэиологические характеристики.

Анализ полностью гидролизованных клеток штамма S. сйгошойцзсиз показывает наличие LL-диаминопимелиновой кислоты. Анализ на сахар полностью гидролиэованных клеток показывает присутствие глюкозы, маннозы, рибозы и рамнозы. Эти результаты показывают, что стенка клетки данного штамма является стенкой клетки типа 1.

Использование источников углерода.

Использование углерода определяют на основной среде ISP, в которую вводят стерилизованные источники углерода, до конечной, концентрации 1,0Х ° Чашки о с культурой термостатируют при 30 С и анализируют. по прошествии 14 дней (при этом знак минус (-) означает без использования, плюс (+) использование,.(+) сомнительное использование)., Отсутствие углерода

L-Арабиноза

D-Фруктоза

D-Глюкоза -Инозитол

D-Маннитол

Раффиноза

<-Р амноза

Сахароза

D-Ксилоза

D-Арабиноза

Циллобиоза

D-Галактоза.

Лактоза

D-Мальтоза

Мельбиоза

Ацетат,натрия

Цитрат натрия

Сукцинат натрия

1403991

D-Рибоза +

Сали цил

Штамм гидролизует крахмал и час тично снятое молоко. На снятом молоке образуется темно-коричневое кольцо. Желатин не гидролизует. В ТЯР В 8 бульон органического нитрата не восстанавливает нитраты до нитритов.

Максимально допустимая концентрация хлористого натрия примерно до 7Х.

Температурный оптимум примерно от 15 до 40 С.

Образование меланоидного пигмента.

Среда Образование пигмента

ХБР М 1

Бульон триптонно-дрожжевого экстракта +

ISP H- 6

Скошенный агар пептонно-дрожжевого экстракта железа +

ХЯР У 7

Тирозиновый агар +

ISP В 7

Скошенный агар без тирозина

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Продуцирование и выделение А-583б5 факторов.

Лиофилизованную гранулу S. сЬгошоfuscus ИВЫ 15098 используют для инокулирования 50 мл стерилизованной вегетативной среды трехпроцентного триптикаэного соевого бульона, содержащего 1Х глюкозы. Инокулированную о среду термостатируют при 30 С в течение 48 ч при одновременном взбалтыва нии. Вегетативную среду используют для инокулирования второй среды сле дующим образом: две колбы емкостью по 2000 мл, каждая иэ которых содержит по 400 мл трехпроцентного триптиказного соевого бульона с введением

1Х-ной глюкозы, инокулируют (каждая)

10 мл вегетативной среды посевы терФ о мостатируют в течение 24 ч при 30 С.

Полученные культуры иснольэуют для инокулирования 100 л продуцирукнцей среды, имеющей следующий состав, r/ë:

Противопенное средство А

Dow-Corning 0,2

Картофельный декстрин

Дрожжи

Пептон ОИ

СОС1 СН О

1-Пролин

N-Z Амин А

Деионизированная вода

0,25

0,01

До объема среды

100 л

При этом ОМ пептон представляет . собой растворимый мясной пептон N-Z

Амин А — ферментативный гидролизат казеина.

Величину рН среды доводят до 7,0 посредством 5 н. гидрата окиси натрия до стерилизации. После стерилизации данную среду инокулируют упомянутой культурой и осуществляют брожение при о

25 С в течение 90 ч. В процессе брожения через среду пропускают стерильный воздух. при одновременном перемешивании со скоростью, достаточной для поддержания содержания растворенного кислорода среды примерно 30-40Х от

25 насыщения воздухом.

Величину рН среды увеличивают в процессе брожения до конечного значения 8,3.

В процессе брожения среду анализи3р, руют на содержание А-58365 фактора с использованием системы PHLC. Факторы обнаруживают по флюоресценции с использованием спектрофотофлуорометра

Schoeffel модели FS 970 длиной волны

327 нм и с фильтром с ограниченной полосой пронускания 370 нм. Анализируемая продуцирующая среда показывает примерно 11,5 мкг/мл фактора после

90 ч брожения.

40 При осуществлении брожения, как описано вьшге, три отдельные среды бро" жения объемом по 100 л каждая, нахо" дящиеся в бродильных чанах, подкисляют концентрированной соляной кисло45 той до величины рН 2,0. Полностью подкисленные бульоны брожения объединяют и фильтруют с использованием в качестве вспомогательного порошка фильтро-, вания 2Х-ного Hyflo. Величину рН от О Фильтрованного бульона брожения дово- . дят до 7,0 посредством 5 н. гидроокиси натрия. Не содержащую функциональных групп смолу Diaion HP-20 доводят в нейтральный питательный бульон в количестве, соответствующем одной десятой части объема отфильтрованного бульона и смесь смола — бульон переь мешивают в течение 2 ч. Бульон отделяют от смолы и подкисляют до величи5 140399 ны рН, равной 2,01 посредством 5 н. соляной кислоты. Подкисленный бульон быстро охлаждают и фильтруют с целью удаления неактивных осажденных про5 дуктов. Подкисленный бульон вводят в колонку длиной 20 дюймов и диаметром (внутренним) 4 дюйма, содержащую

20 л смолы Diaion НР20,и выходящий из колонки поток удаляют. Колонну за- 10 тем промывают 60 л 0,3Х-ного водного раствора муравьиной кислоты и выходящий из колонки поток удаляьт. Затем факторы А-58365 элюиру бт 100 л порциями элюента с переходом от водымуравьиной кислоты (99,7:0,3 об.:o6.) к ацетонитрилу — воде — муравьиной кислоте (20:79,7:0,3 об.:об.:об.) и собирают фракции объемом 2 л. Фракции

27-48, содержащие фактор А, объединя- 20 ют,и концентрируют в вакууме до объема 750 мл. Элюирование осуществляют

20 л смеси ацетонитрил-вода-муравьиная кислота (20:79,7:0,3). Фракции

56-63, содержащие фактор В, объединя- 25 ют и концентрируют до объема 350 мл.

Концентрат, содержащий фактор А, вводят в колонку размерами 9,3 см

"80 см (5 л), наполненную смолой

Dowex 50W Х 2 (Н ), и эту колонку 30 элюируют примерно 17 л деионизированной воды. Однолитровые фракции от

9-15-литровых фракций элюированного объема, содержащие фактор А, извлекают, объединяют и концентрируют до объема примерно 200 мл.

Концентрат, содержащий фактор А (РН 2-3) фильтруют и подвергают хроматографическому разделению методом

HPLC с обратной фазой в колонке раз; g0 мерами 8 см 1 м (Jobin Iron Chroma озрас Pred instrument), наполненной примерно 2,5 кг,(4-4,5 л) октадецилсиланизированного силикагеля Mhatman

ЕР-1. Колонку элюируют сначала 2 л смеси муравьиная кислота-вода (0,3:

:99,7 об.:об.), затем .5 л смеси ацетонитрил-муравьиная кислота-вода (1,0:

:0,3:98,7, об.:об.:об.) и 20 л смеси ацетонитрил-муравьиная кислота-вода 50 (2,5:0,3:97,2, об.:об.:об.). Собирают фракции объемом 500 мл. Фракции 3244, содержащие фактор А, объединяют и концентрируют путем выпаривания до объема 200 мл.

Содержащий фактор А концентрат, полученный при хроматографическом разделении HPLC, вводят з колонку размерами 2,5 см " 30 см (180 мл) на1 6 полненную смолой Biokex 5 (Cl ) 100200 меш.

Смолу промывают деионизированной водой, при этом промывку и выходящий из колонки поток удаляют. Колонку элюируют 400 мл 0,20 М хлористого натрия и затем 2200 мл 0,35 М хлористого натрия. Получают фракции объемом

20 мл и фракции 106-140,. содержащие чистый фактор А, объединяют. Величину рН объединенных фракций доводят до

2,3 путем добавления 1 н. соляной х кислоты и подкисленные объединенные фракции вводят в колонку размерами

2,.8 см х 19 см (120 мл), наполненную смолой Diaion НР20 в 0,01 н..соляной кислоте. Колонку промывают сначала

100 мл деионизированной воды, подкисленной до рН 2,3, разбавленной соляной кислотой, затем 220 мл деионизированной воды (рН 5,9) и затем элюируют 340 мл смеси ацетонитрил-вода (15:85, об.:об,). После получения фракций в объеме 180 мл их извлекают, фракции от 0 до. 180 мл вытекающего потока собирают, объединяют, концентрируют путем выпаривания и лиофилизируют, в результате чего получают

1,31 г чистоro фактора А.

Концентрат объединенных фракций, содержащих фактор В, элюированных из колонки, наполненной смолой Diaion

Hp-20, как описано выше,, вводят в.колонку размерами 9,3 см > 80 см (5 л), наполненную смолой Dowex 50W 2 (Н цикл). Эту колонку элюируют 32- л деионизированной воды, и фактор В соби-, рают в однолитровых фракциях от 1014 л эпюата, Активные фракции объединяют и концентрируют до объема примерно 250 мл.

Затем концентрат, содержащий А58365 фактор В, подвергают тому же хроматографическому разделению методом HPLC c обратной фазой, как описано выше, для очистки фактора А. Колонку элюируют сначала 2 л смеси муравьиная кислота — вода (О, 3: 99, 7 об. X), затем смесью ацетонитрил — муравьиная кислота — вода (6,0:0,4:93,7 об.7) и после этого смесью ацетонитрил— муравьиная кислота — вода (15,0:0,3:

:84,7, об. ). Извлекают ряд фракций объемом примерно 500 мл. Фракцию 24, содержащую фактор В, концентрируют путем выпаривания до объема 100 мл.

Концентрат фактора В дополнительно очищают с помощью . анионообменной

1403991

0,25

1

0,01 смолы следующим образом. В колонку размерами 2,0 см (внутренний диаметр)»

«25 см, на,.злненную анионообменной смолой Bio Rex 5 (Cl ) вводят концент5 рат, и эту колонку элюируют сначала

200 мл 0,2 М хлористоro натрия, а затем 1600 мл 0,35 М хлористого натрия. Извлекают ряд фракций объемом

10 мл и фракции 192-110 объединяют. 10

Величину рн объединенных фракций доводят до значения 2,3 1 н. соляной кислотой и подкисленные объединенные фракции вводят в колонну размерами

8 мм (внутренний диаметр)х20 ом (10 мл),15 наполненную смолой Diaion HP-20 в

0,01 н. соляной кислоте. Колонку промывают сначала 300 мл деионизированной воды (с величиной рн до 2,3}, затем 14 мл деионизированной воды 20 (рн 5,9). Выходящий поток и промывку удаляют и фактор В элюируют 44 мл смеси ацетонитрил-вода (15:85 об.Ж), Собирают ряд фракций объемом 2 мл. фракции 8-!1 объединяют и концентри- 25 руют до объема 1 мл. Койцентрат лиофилизируют, в результате чего получают 2,9 мл чистого фактора В.

Пример 2. Продуцирование

А-58365 факторов А и В в среде выра" щивания, пополняемой пролином и лизином.

S. ehromofuscus NRRL 15098 выращивают в вегетативной среде, приготов" ленной и культивированной, как описано в примере 1, и эту среду выращива35 ния используют для инокулирования родуцирующей среды, имеющей следующий состав, г/л:

Картофельный декстрин 25

NZ Амин А (ферментативный гидролизат казеина)

Дрожжи

Ь-Пролин 45

Мясной экстракт

СОС, 6Н,0

L-Лизин 2

Деионизированная До объема обвода щего 1000 мл .5О

Величину рн среды доводят до 2,0 посредством 5 н.гидрата окиси натрия до стерилизации. После стерилизации данную среду йнокулируют и культивируют при 30 С в течение 96 ч.

В процессе брожения культуральную жидкость анализируют на содержание фактора с использованием. описанной системы HPLC.

Фактор В извлекают из отфильтрованной культуральной жидкости, отделяют и очищают путем хроматографического разделения, как описано в примере 1.

Пример 3. Получение сложного диметилового эфира А-58365 фактора А.

А. К раствору 319 мг А-58365 фактора А в 7,5 мл метилового спирта до-,. бавляют 2,5 мл метилового спирта, содержащего 4 вес.Ж хлористого водорода, и раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 140 мин. Смесь этерйфицирования затем выпаривают досуха и остаток после выпаривания растворяют примерно в 20-25 мл воды.

Величину рн раствора доводят до 6,8 и раствор выдерживают при комнатной температуре в течение ночи. После выдержки величину рн водного раствора повышают от 6,2 до 7,1 и затем раствор трехкратно экстрагируют 100 мл порциями хлористого метилена. Соединенные экстракты дают примерно 15 1мг диметилового сложного эфира фактора А.

B. Раствор 35 мг фактора А в

4,5 мл раствора трифторида бора в метиловом спирте (14% BF в безводном метиловом спирте) нагревают при перео мешивании при температуре - 65 С в течение 2,5 ч. В ходе реакции воздух удаляют из реакционного сосуда. После этого реакционную смесь концентрируют путем выпаривания до объема примерно

1,5 мл и концентрат растворяют в 10 мл воды. Водный раствор пятикратно. экстрагируют равными объемами хлористого метилена,. экстракты объединяют, промывают 5 мл воды, высушивают над сульфатом натрия, фильтруют и выпаривают досуха, в результате чего полу-чают 24,4 мг сложного диметилового эфира фактора А.

Il p и м е р 4. Получение сложного диэтилового эфира А-58365 фактора А, сложных моноэтиловых эфиров.

Раствор 507 мг фактора А в 15 мп абсолютного этилового спирта охлаждают. в ледяной бане и к раствору добавляют 10 мл абсолютного этилового спирта, содержащего 3 вес.% хлористого водорода при одновременном перемешивании. Реакционную колбу промывают азотом, закрывают пробкой и выдерживают при комнатной температуре.

Процесс этерификации сопровождается анализом HPLC небольших аликвотных проб реакционной смеси, отбираемых

1О

Щелочные условия: 243 им=7200

=355 нм = 7400

Фактор А имеет характерную картину флюоресценции. Приведенный ниже флюоресцечтный спектр фактора А получен с использованием спектрофлюорометра

Amino — Bowman в водном растворе фактора А в кислотных, нейтральных и щелочных условиях.

Кислотные условия, нм:

Максимум возбуждения 327

Максимум излучения 398 Нейтральные условия, нм;

Максимум возбуждения 324

Максимум излучения 396

Щелочные условия, нм:

Максимум возбуждения 350

Максимум излучения 424

Спектр С ЯИР фактора А получен с помощью спектрометра ЯИР Bruker модели MN270. Спектр показывает нижеследующие характеристические сигналы. С ЯМР (67,9 МГц, Д О): 8 25,66 (1Сф t); 26,76 (1С, t); 27,66 (IC, t);

33 19 (1С, t); 63 80 (1С, d); 128 52 (1С S); 134,72 (1С, d); 135,20 (1С,S);

136 „06 (1С, S); 159,86 (1С, $);

174,42 (1С, 8); 177,89 (1С, S) (t триплет, d -1-дублет, S -синглет).

Инфракрасный спектр поглощения имеет следующие адсорбционные пики:

ИК (KBr) Частота, см Интенсивность

3500-2700 br, S

2960 W

2700-2400 br, ш

1719 S

1660 Shd

1526 S

1440 ш-w

1410 -S

1320 S

П2

1210 ш

1126 W

1055 VW

1028 W

957 VM

911 W

878 VW

836 VM

При этом приняты следующие обозначения: br — широкий, m — - средний

$ — сильный, Ч/ — слабый, VW — очень слабый, ш-S от среднего до сильного, ш-M — от среднего до слабого, Shd— размытый., Ниже приведены характеристические сигналы спектра Н ЯМР 1Н ЯМР (360 МГц, 9 1403991 время от времени. По прошествии 8 ч реакционную смесь разбавляют 50 мл воды и величину рН водного раствора доводят до 6,9 посредством разбавленного гидрата окиси натрия. Раствор выпаривают с целью удаления этилового спирта и водный концентрат разбавляют водой до объема 40 мл и обрабатывают разбавленным гидратом окиси натрия, 10 доводя величину рН до 7,09. Затем раствор четырехкратно экстрагируют

50 мл порциями хлористого метилена и экстракты соединяют, промывают

20 мл воды, высушивают над сульфатом натрия и выпаривают досуха в вакууме, в результате чего получают 222 мг сложного диэтилового эфира фактора A.

Величину рН водной фазы от указанной экстракции сложного диэтилового 2р эфира доводят до 1,95 посредством соляной кислоты и экстрагируют пять раз 50 мл порциями хлористого метилена. Экстракты объединяют, промывают разбавленной кислотой и удаляют. Кис- 25 лотную водную фазу четырехкратно экстрагируют 50 мл порциями этилацетата и экстракты объединяют и промывают разбавленной кислотой. Этилацетатный экстракт и метиленхлоридный 30 экстракт объединяют, высушивают над сульфатом натрия и выпаривают досуха.

Получают 257 мг смеси сложных моноэтиловых эфиров фактора А. Анализы методом HPKC и ЯМР (360 МГц) показывают, что это смесь 9.: 1 сложных моноэтиловых эфиров.

Физико-химические свойства полученных продуктов.

А-58365 фактор А. Фактор А белый 40 аморфный порошок, хорошо растворимый в воде и полярных органических растворителях, таких как метиловый спирт, этиловый спирт, диметилформамид и. диметилсульфоксид, но плохо раствори- „ . мый в ацетоне и нерастворимый в таких углеводородных растворителях, как бензол и гексан.

Фактор А поглощает излучение в ультрафиолетовой области спектра.

Указанный абсорбционный спектр ультрафиолетовой области фактора А получен с использованием водного раствора фактора А в нейтральных, кислотных и щелочных условиях.

Нейтральные и кислотные условия:

232 нм Я =6000 (из расчета МВт=267)

Ъ„ „, 325 нм с.=7600 (из расчета МВт=

=267) 1403991,12

080)- g 2»30 (1Н, м); 2,57 (1Н» m)»

2,64 2,4 (1Н, Й ) 1 2,81 (1Н, с% ) ф

3 05 (fH дД) Р 3,15 (1Н,ddd)» 5»0 (1H,dd); 7,33 (1H S) °

Мол. вес фактора А составляет 267.

Бомбардировка быстрыми атомами (РАВ)ш(е 268; десорбционный массспектр m/е 267,223; FAB высокого разрешения: m/е 268,081890, рассчитанная 10

268,08211 для С, Н, НО (M+H ).

Элементарный анализ, осуществляемый на образце фактора А, показывает следующий состав на основе змпиричес- кои формулы C zH>NOe. 15

СООС вЂ” СК 3 СН3

О СООН

Рассчитано, Ж: С 53,93; Н 4,90»

N 5,24;

Найдено, Ж: С 53,72; Н 5»10» . 25

N 6,16.

Фактор А имеет следующее значение удельного вращения плоскости поляризации: о . " (С1Х, Н О) - 199,5 .

Электрометрическое титрование, 30 осуществляемое на образце фактора А в 66Х-ном днметилформамиде» показывает наличие трех титруемых групп: рК=

=5»7» 7»5» 12»3 °

А-58365 фактор В. Фактор В имеет характеристики, близкие к фактору А, отличаясь от него в отношении струк-: туры одним метиленовым звеном.

Инфракрасный абсорбционный спектр 4@ фактора В содержит следующие хорошо различимые абсорбционные пики:.

ИК (KBr): Частота,.см Интенсивность

3600-2800 br Й

2960 ш-W

2700-2400 br, W

1717 S

1652 S

1538 S

1436

1412 S

1 350 VW

1280 m

1220 ш

1157

1072 W

1049 W 1002 . W

906 W

783 m-W

639 br, W

Спектр протонного магнитного резонанса (?Н ЯМР) для фактора В содержит следующие сигналы: ХН ЯМР (360 МГц, Л О ): 8 1,67 (IH» ш);

1,86 (7Н, m); 2,08 (ХН» m); 2,35 (fH»

m); 2,66 (2Н, t); 2,76 (M, m); 2,78 (2Н, ш); 2,93 (ХН, ш); 5,10 (1Н» dd);.

7,35 (fH, S) (m — мультиплет).

Спектр углеродного ядерного маг"н нитного резонанса фактора В показывает,следующие сигналы: ..С .ЯМР (67,9 МГц, Д О): 5 16,08 (1С,t);

23,43 (1С,t), 26,07 (1С, t); 26,36 (1C, t); 33,44 (1с,.t); 58,03 (1С, d);

126,60 (1C, S); 132,88 (1С, S);

133 06 (1С, с1)р 137, 13 (1С, S);

161,73 (1C, S)»ð 176,97 (1С, S);

178,57 (1C, S) .

Фактор В поглощает излучение в ультрафиолетовой области спектра и также»как и в случае фактора А, максимумы, наблюдаемые в нейтральных и кислотных условиях, смещаются в сторону большей длины волны при вводе основания. Максимумы, наблюдаемые для водного раствора фактора В, имеют следующие значения:

Нейтральная и кислотная среда: м »кс и 232 нм (f«3800)» макс 335 нм (3=5600). X „ при 232 нм смещен к

244- нм в основании, в то время как

% О„ смещен к 360 нм, также в основании.

Фактор В также, как и фактор А, флюоресцирует синим цветом при длин" новолновом УФ-излучении.

Мол. вес фактора В составляет

281, как определено методом массспектрального анализа.

Десорбционный масс-спектр: m (е 231 /M+) .

На основе анализа физических и спектральных характеристик фактора В он имеет следующую эмпирическую фор- . мул СвН НО или структурную формулу

ОБ

ЕООС-СН2-СН2, О С00Н

Сопоставительный анализ спектральных данных факторов А и В показывает, что фактор В является более высокомолекулярным гомоголом фактора А.

1403991

Характеристики растворимости фактора В аналогичны характеристикам растворимости фактора А. Фактор В xoporno растворим в воде и полярных ор- 5 ганических растворителях, таких как метиловый спирт, этиловый спирт, диметилформамид и диметилсульфоксид, но плохо растворим в ацетоне и нерастворим в углеводородных растворителях, таких как бензол и гексан.

А 58365 фактор С. Фактор, образуемый в меньшем количестве, чем факторы

А и В, получают из культуральной жид- кости штамма S. chromofuscus ШИ

15098 и обозначен,как А-58365 фактор

С. По своим свойствам фактор С анало» гичен как фактору A так и фактору В.

Как и указанные факторы, фактор С флюоресцирует синим цветом при длин- ;и новолновом ультрафиолетовом излучении.

Молекулярный вес фактора С составляет 295, как определено методом : 25 масс-спектрального анализа.

Десорбционный масс-спектр! m (е

295 N }, Фактор С имеет эмпирическую форму". лу С, Н„ИО . . 30

Факторы А-58365, хотя и аналогичны, но имеют характерные значения времени удерживания при жидкостной хроматографии высокого разрешения (HPLC). Отдельные Факторы, могут быть отделены друг от друга методом HPLC, Система, используемая для разделения факторов, представляет собой колонку

Haters Associates u Bondapak С18, размерами 4 мм 300 мм, со станционарной фазой. Используемая подвижная фаза состоит из.67 ацетонитрила (О,ЗЕ муравьиной кислоты), 93,77 воды, скорость потока подвижной фазы составля ет 2,5 мл/мин. Для обнаружения наличия факторов в системе используется характерная для них флюоресценция, Флюоресценция определяется с помощью спектрофотометра Schoeffel

:FS 970. 50

Время удерживания факторов в указанной системе HPLC имеет следующие значения, мин: А 4,88; В 12,47; С

18 21.

Биологические свойства.

А-58365 факторы формулы (< г)л лоос- сн -си о соотг где n = 1 или 2, R,,R — - одинаковые или различные и означают 8 или С,-С -алкил, ингибируют действие фермента превращения ангиотензина, что подтверждено исследованиями, проводимыми вне живого организма (в условиях in vitro) с использованием подвздошной кишки, извлеченной из морской свинки. Испытания в условиях in vitro осуществляли следующим образом: сегменты (дли ной 2-3 спи) подвздошной кишки морской свинки помещают в вытянутом в про дольном направлении состояния в 10мл клеточной :.ванны, содержащей раствор

Крэбса, имеющий следующий состав (молярные концентрации): хлористый натрий 118 2, хлористый калий 4,6, дигидрат хлористого кальция 2,5, нервичный кислый фосфорно-кислый калий

1,2, сульфат магния 1,2, декстроза

f0,0 и бикарбонат натрия 24,8, во всех экспериментах ткани поддерживают при 37 С и осуществляют насыщение ванны смесью, состоящей из 95Х кислорода и 57, двуокиси углерода. Подвздошную кишку закрепляют между двумя электродами, состоящими из стержней из нержавеющей стали (основание) и кольцевой платиновой проволоки (верх).

Прямоугольные импульсы (0,1 Гц) сверхмаксимального напряжения (40 В) и продолжительностью 0,7 мс .создают посредством стимулирующего устройства

Graas S 44 Ткани приводят в равно-. весие в течение 1 ч при воздействии нагрузки 1 r. Изометрические реакции регистрировались на динографе Бекмана.

Получают кривые концентрация — реакция К 3 или 4 концентрациям ангиотензина 1. Затем ткани вновь приводят в равновесие с А-58365 фактором (10—

10 моль) и снова регистрируют кри-5 вые концентрация — реакция к ангиотензину I, Каждая ткань получает лишь одну концентрацию фактора.

Во всех случаях происходит значительное смещение кривой сокращения

l 403 991

16 реакции на ангиотенэин I. Ингибирование АСЕ в подвэдошной кишке морской свинки было конкурирующим, Данные, полученные с факторами А и В в опи-. санном испытании, демонстрируют такS же, что факторы А и В не ингибируют выделение ацетилхолина и не блокируют холинэргические рецепторы. В системе in vitro А-58365 факторы А и В де1О монстрируют фармакологическую способность ингибировать АСЕ.

А-58365 факторы являются гипотоническими средствами, которые благодаря их способности ингибировать фермента- 15 тивное расщепление ангиотензина I до . прессоагента ангиотензина II в клетках млекопитающих животных являются ценными гипотоническими средствами. Способность факторов, ингибирующих ACE понижать кровяное давление продемонстрирована с фактором А на крысах с очищенным желудком.

Полученные по предлагаемому способу соединения могут быть использованы25 для понижения кровяного давления < т страдающим гипертонией млекопитающим животным. Данные факторы или их фар" мацевтически пригодные соли могут вводиться в организм индивидуально или в комбинации с фактором В. При практическом осуществлении данного способа А-58365 фактор или его фармацевтически пригодная соль вводится в организм через рот, путем внутримышечной,, внутривенной или подкожной инъекций. Для парэнтерального ввода

А-58365 фактор или его фармацевтически пригодную соль растворяют в физиологически пригодном растворе, предназначенном для инъекции. Для данной цели могут быть использованы соответствующие физиологические разбавители, такие как вода для инъекции, О;9%-ный солевой раствор, 5Х-ная глюкоза и другие общеизвестные разба45 вители. Для ввода через рот А-58365 фактор или его фармацевтически пригодная соль могут вводиться в организм, в виде капсул, таблеток или жидких суспензий. А-58365 фактор или его фармацевтически пригодная соль могут быть введены в организм в виде нетоксичной единичной дневной дозы, составляющей примерно от 100 до 2000 мг/

/кг веса пациента, или в виде нескольких дневных доз. Точный режим ввода препарата зависит от таких факторов, как степень гипертонического заболевания и переносимость лекарства отдельным пациентам, а также от дру гих факторов.

Сложные эфиры А-58365 фактора также обладают свойствами ингибировать

АСЕ. Ацилоксиметиловые сложные эфиры, также как и инданиловые и фталидиловые сложные эфиры данных факторов, являются лекарственными формами факторов, используемых для приготовления рецептур данных факторов для ввода в организм через рот. Кроме того, сложные алкиловые диэфиры (с содержанием 1-6 атомов С) используются для извлечения и очистки факторов методами хроматографии.

Ф о рм ул а и з о б р е т е н ия

1. Способ получения ингибитора фермента превращения ангиотензина общей формулы

CH2=CH 2

О coom где n = 1 или 2;

К и К,г одинаковые или различные, означают Н или С -С -алкил ! Р отличающийся тем, что штамм Streptomy«es chromofuscus NRRL

15098 культивируют при 25- 30 С и рН

7-8,3 в жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в глубинных аэробных условиях с последующим разделением целевого продукта на отдельные факторы и при необходимости полученный фактор А этерифицируют, 2..Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что выделяют А-58365 фактор А формулы

СООТà — СН2- СЕ, О СООН

3 Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что выделяют -58365 фактор В формулы

1403991

5. Способ по пп.1 и 3, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью повышения выхода А-58365 фактора В

1 в питательную среду добавляют по

1.-3 г/л пролина и лизина или 3 г/л среды пролина.

6. Штамм стрептомицета Streptoшусев chromofuscus NRRL 15098, ис10 польэуемый для получения.ингибитора фермента превращения ангиотензина.

4. Способ по пп.1 и 2, о т л и ч а ю щ и Й с я тем, что, с целью повышения выхода А-58365 фактора А, в питательную среду добавляют 1-5 г/л среды пролина.

Составитель Г. Смирнова

Редактор М.Недолуженко Техред M.Äèäûê Корректор Г.Решетник

Заказ 3007/58 Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб, д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, (