Способ получения эндонуклеазы рестрикции fок1 из flаvовастеriuм океаnокоiтеs

 

Изобретение относится к микробиологии , в частности к способу получения рестриктаз. Целью изобретения является повьшение выхода ректриктазы Fok I. Для этого штамм-продуцент Flavobacterium okeanokoites В-2835 культивируют на жидкой питательной среде, содержащей, г/л: пептон 9,0-11,0; дрожжевой экстракт 4,0-6,0; NaCl 25,0-30,0; КС1 0,5- 1,0; ,,20 2,0-3,0; MgS04 7H20 6,0-7,5; глюкоза 0,5-1,5, до достижения стационарной фазы роста с последующим вьщелением и очисткой рестриктазы, включающей 3 хроматографические стадии. Способ позволяет увеличить выход фермента в 8-10 раз.. Выход фермента 2000 ед. на 1 г биомассы , активность препарата 3000 ед./мл. 1 табл. с . (Л 4ik О Од а о

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)4 С 12 N 9/16 // (С 12 N 9/16, С 12 Н. 1:20) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОбРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4097789/28-13 (22) 15. 05. 86 (46) 30.06.88. Бюл. В 24 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии (72) С.Х.Дегтярев, П.А.Белавин, В.E.Репин и Э.Г.Малыгин (53) 577.15 (088.8) (56) Holdeman L.V Cato Е.P. Mo; ore W Е.С. Anaегоbe laboratory manual 4 в eg. Virginia Polytechnic Institute and State University, Blackburg, 1977.

Sugisaki Н., Kanazawa S. New restriction endonucleases from F1avobacterium okeanokoites (Fok I) and Microeocus luteus (Mlu I), Gene, 16, 7378, 1981.

„.Я0„„1406160 А1 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ

РЕСТРИКЦИИ FOK I ИЗ FLAVOBACTERIUM

OKEANOKOITES (57) Изобретение относится к микробиологии, в частности к способу получения рестриктаз. Целью изобретения является повышение выхода ректриктазы Fok I. Для этого штамм-продуцент Flavobacterium okeanokoites

В-2835 культивируют на жидкой питательной среде, содержащей, г/л: пелтон 9,0-11,0; дрожжевой экстракт

4,0-6,0; NaC1 25,0-30,0; КС1 0,51,0; .СаС1 6Н,20 2,0-3,0; MgSO< 7Н О

6,0-7,5; глюкоза 0,5-1,5, до достижения стационарной фазы роста с последующим выделением и очисткой рестриктазы, включающей 3 хроматографические стадии. Способ позволяет увеличить выход фермента в 8-10 раз..

Выход фермента 2000 ед. на 1 г биомассы, активность препарата

3000 ед./мл. 1 табл.

1406160

Изобретение относится к микробиологии и касается способа получения ферментов нуклеинового обмена, в частности рестриктаз.

Целью изобретения является повышение выхода фермента.

Способ заключается в том, что штамм F.okeanokoites выращивают на жидкой среде следующего состава,г/л:

Пептон 9,0 — 11,0

Дрожжевой экстракт 4вО бьО

NaC1 25,0 — 30,0

КС1 0,5 — 1,0 l5

СаС1 6 Н О. 2,0 — 3,0

MgSOy. 7 Н О 6,0 — 7,5

Глюкоза 0,5 — 1,5 рн 7,2, культивирование проводят при 27-29 С, 20 до стационарной фазы роста, что соответствует оптической плотности 2,22,6 о.е. при r1=550 нМ. Клетки разрушают ультразвуком и целевой продукт получают последовательной хроматогра- 25 фической очисткой на фосфоцеллюлозе

P-1i, бензил-ДЕАЕ-целлюлозе и фосфоцеллюлозе В- 11.

Культивирование бактерий на среде, имеющей сбалансированный состав со— лей, .и при оптимальной температуре

27-29 С приводит не к увеличению выхода биомассы, а к ее обогащению именно ферментом рестрикции и повышению выхода целевого продукта в 8- 10 раз по сравнению с известным способом.

Выбор температуры культивирования обусловлен следующими эксперименталь- 40 ными фактами: изменение на 4-5 С в о любую сторону от оптимального интервала (27-29 С) уменьшает скорость роста F.okeanokoites в 2 раза и не позволяет получить более высокий выход фермента.

Результаты экспериментов по подбору компонентов питательной среды для культивирования F.okeanokoites пред-. ставлены в таблице.

Наиболее оптимальной и сбалансированной по составу солей является среда 15.

Выход фермента в логарифмической фазе роста повышается в 1,1-1,2 раза по сравнению со стационарной фазой, 55 однако полученный препа.рат фермента не стабилен при хранении (50 инакти— вация за 1 неделю).

Установлено, что для получения стабильного при хранении препарата фермента сбор урожая бактерий наиболее технологично производить на стадии стационарной фазы роста.

Пример. Получение рестриктазы Рок Т.

Культивирование F.okeanokoites.

При культивировании клеток используют химреактивы отечественного производства без дополнительной очистки.

Для выращивания бактерий готовят растворы питательной среды.

Раствор 1: Пептон 10 r

Дрожжевой экстракт 5 г

NaC1 27 r

КС1 0,7 г

Вода 900 мл

Раствор кипятят 5 мин, охлаждают до комнатной температуры, фильтруют через фильтровальную бумагу, доводят рН до 7,2 с помощью 5 н, раствора

NaOH.

Раствор 2: MgSOy 7H O 7 г

Вода 50 мл

Раствор 3: СаС1 6Н О 2,2 г

Вода 40 мл

Раствор 4: Глюкоза 1 г

Вода 10 мл

Все растворы стерилизуют в автоклаве при 121 С 40 мин, затем сливают о в стерильных условиях непосредственно перед приготовлением питательной среды.

Клетки бактерий подращивают на твердой питательной среде при 28 С в течение суток, затем готовят инокулят для засева ферментера. Объем инокулята 1/10 часть от объема ферментера. Культивирование проводят в феро ментере (объем 20 л) при 28 С и аэра— ции 20 л/ч. Величина рН в процессе роста поддерживается автоматически на уровне 7,2 добавлением 0,2 н, NaOH.

Клетки выращивают до стационарной .фазы (оптическая плотность 2,5 при

3=550 нм). Клетки собирают центрифугированием при 5000 g в течение

10 мин. Выход биомассы 3,5 г/л.

Выделение и очистка рестриктазы.

Все процедуры по выделению и очистке фермента проводят при Π— 4 С.

4 г клеток суспендируют в 20 мл 0,01 M трис-НС1 буфера, рН 7,5, содержащего

0,1 тритона Х-100, разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе 4 раза по 40 с, клеточный дебрис отделяют

140 центрифугированием при 5000х8 в течение 20 мин, Полученный грубый экстракт наносят на колонку с фосфоцеллюлозой P- 11 размером 1,5х5 см, уравновешенную 0,02 M трис-HCI буфером, рН

7,5, содержащим 1 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,5 MM ЭДТА и 57 глицерина (by—

1 фер А). Несорбированный на колонке материал элюируют 50 мл буфера А.

Фермент элюируют 20 мл буфера А, содержащего 1 M NaC1 и диализуют против буфера b (0,02 М калий фосфатный буфер, рН 7,5 содержащий 1 MM 2-меркаптоэтанола, 0,5 MM ЭДТА и 5Х глицерина).

После диализа раствор фермента осветляют центрифугированием при

3000хя в течение 5 мин и супернатант наносят на колонку размером 0,9х5 см с бензил-ДЕАЕ-целлюлозой.

Несорбированный материал, содержащий фермент, собирают и наносят на колонку размером 0,9 х 2 см с фосфоцеллюлоэой P- 11, уравновешенной буфером Б.,Фермент элюируют 40 мл линейного градиента NaC1 (0,1 M) в буфере Б. Фракции, содержащие растриктазу (элюируемые при 0,4 — 0,45 M NaC1), собирают и диализуют против буфера Б, содержащего 50Х глицерина. :Выход продукта составляет 2000 ед./г биомассы. Полученный препарат имеет активность 3000 ед./мл. Активность фермента определяют в реакционной смеси, которая в 20 мкл содержит 1 мкг ДНК фага А, 0,02 M трис — НС1 буфера, рН

7,5, 0,01 M М8С11, 0,02 M КС1, 1 мМ

2-меркаптоэтанола. о

Реакцию проводят при 37 С в течение 1 ч, затем пробы подвергают элект рофорезу в 1Х-ном агарозном геле. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг

ДНК фаза A при данных условиях реакции.

Отсутствие неспецифических эндонуклеаз и фосфотаз подтверждается б!60 высокоэффективным лигированием фрагментов ДНК фага Я, полученных в результате гидролиза полученным препа5 ратом фермента. Правильность лигирования подтверждается повторным гидролизом рестриктазой Fok I с образованием аналогичных фрагментов.

10 Формула изобретения

Способ получения эндонуклеазы рестрикции Fok I из Flavobacterium

okeanokoites, включающий культивирование клеток в жидкой питательной среде, содержащей в качестве источника азота белковый гидролизат, в качестве источника витаминов — дрожжевой экстракт, хлористый натрий, глюкозу и воду, разрушение клеток ультразвуком, хроматографию полученного экстракта на фосфоцеллюлозе и очистку целевого продукта ионообменной хроматографией, о т л и ч а ю—

25 шийся тем, что, с целью повьппения выхода фермента, в качестве продуцента используют Flavobacterium

okeanokoites ВКПМ-2835, в среду для культивирования дополнительно вводят ч0 хлористый кальций, хлористый калий и сульфат магния, в качестве белкового гидролизата используют пептон при следующем соотношении комопнентов, h г/л:

Пептон,9,0 - 1190

Дрожжевой экстракт 4,0 — 6,0

Хлористый натрий 25,0 — -30,0

Хлористый калий 0 5 — 1,0

Хлористый кальций 2,0 — 3,0

Сульфат магния 6,0 — 7,5

Глюкоза 0,5 †. 1,5,, Вода Остальное о культивирование ведут при 27-29 С до достижения стационарной фазы роста, а при очистке целевого продукта ионообменную хроматографию проводят на бензил-ДЭАЭ-целлюлоза с последующей рехроматографией на фосфоцеллюлозе. о о о о о о (7 ю о о ь о в и о о л о л

СЧ л о о л л (Ч о ь л

О л л

I

1 Г 1 о о О о л

О о л о л

СО

D о

1

1 л

I а! I ——

Г(1

Ф I (Г\ л о о

Ю о

С 1 D

М л о л о л л

СЧ

< 4 л

Г! о о л о л

"О о

Ю л о о

00 о л л

Ю

D о л о л л

СЧ о л о о

СО о

Ch о о

1

E и

Ю

С4

V Х о!!!

Е! о хо

Q C

Е, (C4

fQ с5

Е» и о о

l

I

I

I гч I

o o л о л

1406160 с4 О

Ю л

СЧ о о л л

Р1 о о х х л о а к щ с о л о о с.