Способ культивирования мицелиальных грибов - продуцентов рибонуклеаз

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

5 10 А1

09) (И) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСИОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (46) 30.08.90. Бюл. Р 32 (21) 4080583/31-13 (22) 23.06.86 (71) Институт элементоорганических соединений им. A.Н ° Несмеянова

AH СССР и Институт биохимии им. А.Н. Баха AH СССР (72) И.М. Тавобилов, В.И. Лозинский

Р.Ж. Манолов (BG), Е.С. Вайнерман, С.И. Безбородова, С.В. Рогожин и А.М. Безбородов (53) 557.15(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

Ф 1008214, кл. С 08 J 9/26 ° 1982 °

Безбородова С.И. и др. Рибонуклеодеполимериэующая активность Аврег-.

gillus clavatus Besm. Микология и фитопатология, 1969, т. 3, с. 518521. (54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ-ПРОДУЦЕНТОВ РИВОНУЕЛЕАЗ (51) 5 С 12 N 9/22, 1/14//

/(С 12 N 9/22у С l2 R 1:645) (57) Изобретение относится к приклад- ной.микробиологии, конкретно — к способу повышения продуктивности клеток, секретирующих рибонуклеазы (РНКазы).

Изобретение может быть использовано в отраслях промышленности, производящих биохимические препараты, a также в научных исследованиях. Цель изобретения - повышение выхода РНКаэ.

Согласно изобретению, культуры грибов выращивают на агарнзованных средах до получения спорового материала.

Споры иммобилизируют в криогеле 7,515Х-ного поливинилового спирта (IIBC) путем замораживания суспензии спор

s водном растворе ПВС при температуре от -10 до -40 С в течение 8-24 ч

-c последующим раэмораживанием. Споры проращивают и культивируют в иммобилизованном состоянии в питательной . среде, содержащей источник углерода, минеральные компоненты н воду. 1 табл.

1405310

Изобретение относится к прикладной микробиологии, конкретно к crro" собам культивирования мицелиальных грибов, способных в определенных условиях секретировать во внеклеточную среду ферменты, деполимеризующие рибонуклеиновые кислоты. Изобретение может быть использовано в отраслях промьпйленности, производящей биохими- 10 ческие препараты, а также в научных исследованиях, Цель изобретения — повышение выхода целевого продукта.

Изобретение осуществляют следующим образом.

1. Получение спор мицелиальных грибов — культуры грибов выращивают в течение 7-9 сут при 25-27 С на агаризованной среде состава, г/ 100 мл: 20 сахароза 3,0; 1,аИО 0,2, КН РО 0,1;

MgSO4- 7Н О 0,05, KCl 0,05; FeSO< 001; агар 2,0. Образовавшиеся споры смывают стерильной водой.

2) Иммобилиэация спор в частицы криогеля 7,5-15Х-ного поливинилового спирта (ПВС) - зта стадия осуществляется приготовлением суспензии спор в водном растворе ПВС и замораживанием порций полученной суспензии при

0 температуре от -1О до »»40 С в течение 8-24 ч с последующим раэмораживанием образцов. В результате получают частицы криогеля ПВС с иммобилизованными в них спорами того или иного мицелиального гриба, 3) Проращивание спор — для этого частицы криогеля ПЗС с включенными в них спорами помещают на 48-50 ч при

25-27 С в питательную среду следующего состава, г/100 мл: глюкоза 5,0; соевая мука 0„50;пептон 1,0; KN0 .0,2, Ng$O< 7Н О 0,05; СаС1 ° 28<0 0,01.

4) Инкубация иммобилизованных кле- ток в питательной среде — данная ста- 45 дия может осуществляться как в реакторе стационарного режима с периодической сменой питательной среды, так и в реакторах проточного типа., Частицы криогеля ПВС с включенными проросшими клетками мицелиального гриба-продуцента РНКаз загружают в стерильный реактор (возможно также проращивание спор непосредственно в том же реакторе) и заливают питательной средой следующего состава, r/100 ил: глюкоза 5,0, () $0

0,75, KNOg 0,2; КН РО 0 017, NgSOg ° 7Н О 0,051 СаС1 2Н О О ° 02, В случае проточного реактора питательную среду подают непрерывно. Культуральную жидкость (элюат иэ проточного реактора), содержащую секретированные иммобилиэованными клетками

РНКаэы, собирают и далее обрабатывают известными приемами выделения н очистки целевых ферментов.

Иммобилиэация не клеток мицелиального гриба, а его спор, позволяет, во-первых, равномерно распределить микроорганизмы в гелевом носителе, и, во-вторых, это дает воэможность не только сохранить биологи- . ческую активность клеток в иммобили. зованном виде, но и повысить их продуктивность в отношении секреции рибонуклеаэ.

Применение в качестве носителя иммобилизованных клеток криогелей

ПВС, обладающих развитой макропористой структурой, поэволяет, с одной стороны, легко прорастить споры мицелиального гриба после формирования частиц геля, а с другой " обеспечить живым клеткам благоприятные условия подвода питательных веществ и отвода метаболитов. При концентрации ПВС в криогеле ниже 7,5 механическая прочность частиц с включенными клетками мицелиальных грибов становится неудовлетворительной для реакторов с перемешиванием, а использование криогелей с концентрацией полимера выше 15 нецелесообразно иэ-эа большого расхода гелеобразователя.

Температура стадии иммобилизации спор мицелиальных грибов в криогели

IIHC зависит от концентрации раствора полимера-гелеобраэователя, объема замораживаемых порций и имеющегося холодильного оборудования. В предлагаемом изобретении режимы данной стадии выбраны на основании экспериментов и составляют по температуре о о от -10 до -40, по времени — от 8 до 24 ч.

Пленки поливинилового спирта не обеспечивают необходимой для прорастания мицелия макропористости; Сшитый посредством УФ-облучения гель

ПВС также непригоден для выращивания микромицетов, т.к. при облучении устрачивалась способность конидий к прорастанию или наблюдалось снижение активности РНК-азы.

Таким образом, криогель ЛВС по сравнению с другими способами иммо1405310 билизации обеспечивал оптимальные условия для жизнедеятельности мицелиальных грибов — продуцентов РНК-аэ.

Состав питательных сред для полу5 чения спор мицелиальных грибов, для проращинания иммобилизонанных спор и для секреции РНКаз иммобилиэованными проросшими клетками, а также температура и продолжительность этих стадий определены экспериментально.

Приводимые составы питательных сред и условия процессов являются опти-. мальными для используемых микроорганизмов. 15

Изобретение поясняется примерами.

П р и и е р t. Культуру гриба

Aspergillus clavatus 2297t9 выращи о вают при 25 С в течение 9 дней на агаризованной среде состава, 20 г/100 мл: сахароза 3,0 NaNO 0,2;

КН Р04, 0,1; Mg :":04 i 7Н О 0,05; KCl

0,05; FeS04 0,001, агар 2,0. Образо.— вавшиеся споры смывают стерильной водой и перемешивают смыв в течение

5 мин в миксере, после чего доводят б концентрацию опор до 4 10 спор на мл жидкости с помощью стерильной воды.

5 мл водной суспенэии полученных 30 спор смешивают с 45 r водного раствора ПВС, содержащего 3,75 г полимера. Порции полученной суспензии объе0 мом по 250 мл замораживают при -10 С в течение 24 ч. После оттаивания полученные частицы 7,5 -ного криогеля

IIBC с включенными спорами промывают трижды стерильной водой.

Полученные частицы криогеля ПВС с включенными спорами помещают на 48 ч о при 25 С н питательную среду состав, г/100 мл: глюкоза 5,0; соевая мука

0,5, пептон 1,0; KNO> 0,2; MgSO< «

«7Н 0 0,05, СаС1« 2Н 0 0,01.

„Частицы криогеля проросшими иммобилизонанными клетками помещают в питательную среду состава, г/100 мл: глюкоза 5,0; (NH4)z SO4

Oу75, KNOy 0» КН О 4 0 р 017 9 MgSOq

«7Н О 0,05, СаС1 2Н О 0,02. Инкубируют при 25 С в течение 12 сут, меняя среду через каждые три дня.

Суммарный выход РНКазной активности эа 12 сут функционирования иммобили-, эованных клеток составил 10250 ед.акт, на грамм сухого мицелия, в то время как свободные клетки н тех же условиях были способны секретиронать

РНКаэы только в течение 3 сут, а суммарный выход РНКазной активности составил для них 1770 ед.акт. на грамм сухого мицелия °

В таблице представлены данные повьцсоду PHK-аз .в занисимости от продуцента и условий культивирования.

Преимущества изобретения заключаютая в том, что повьппение выхода

РНКаз достигается не эа счет трудоемкой селекции штаммов продуцента, а за счет увеличения сроков продуктивного функциониронания клеток, что позволяет получить хороший выход активности РНКаэ даже н случае не очень активных штаммов (см. 99 5 и

10 в табл.}. Данное обстоятельство важно в случае продуцентов, секретирующих РНКаэы с ценной для практических целей субстратной специфичностью, Улучшение технологичности процесса достигается как простотой отделения клеток от культуральной жидкости при смене среды в реакторах стационарного режима, так и непрерывностью процесса в случае использования реакторов проточного типа.

Формула и э обретения

Способ культивирования мицелиальных грибов — продуцентов рибонукле аз, предусматринающий получение спороного материала продуцента, проращивание его и последующее глубинное культивирование B питательной среде, содержащей источники углерода и, азота, минеральные соли и воду, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, спороный материал мицелиальных грибон перед проращиванием иммобилизуют в частицы криогеля поливинилового спирта путем замораживания в

7,5-15 -ном водном его растворе с по следующим разморажинанием.

5 1405310

6 !

Выход PHK-аз в зависимости от продуцента и условий иммобилизации

Продуцент .PHKas

Условия иммобилизации спор екреция РНКаз клетами продуцента

rt/n название итамм а

-10

10250

24

2297/9

7,5

-25

10,0 l 2750

М

И б " "

12 5 -25 м М

11320

И

1770

Свободные клетки

-30

9880

2286/8

9,0

Ю

2а

960

И

Свободные клетки

8900

2285/1О 11 1

М

За

9250

15 0

Свободные клетки

880

4080

-22

16

10,0

2062

660

Свободные клетки

10,0

-22

3520

12

2283/7

5а

12,5

Ю

4630

И

610

«И

Свободные клетки

4520 . -40

1510

4160

-15

20

10,0

710

Свободные клетки

7 5 -12 . 22

Свободные клетки

И

7а

3830

114А

590

И б

8а

16

9780

10,0

952 А

1а Aspergil"

lus сlаvatus

4а Aspergillus palli-.

dus

6а Peniñillium brevicompactum 31 В

Penici1lium chrysogenum концентрация

II8C i темпе- время ратура замозамора- рааие аивания,С вания, ч

-28 е е

-35 время инкубации, сут. суммарная продуктивность (ед. акт/r суxoro мицелия) 1405310

Продолжение таблицы

- Продуцент РНКаэ екреция РНКаз клет ами продуцента

Ф п/п название штамм температура заморао живания,С б

-30 и

11040

Свободные клетки

69 А о

-35

9а

10

16

11700

Свободные клетки

«н

1530

10а Fusar ium

ОХУ8РОТЬ1Ш о

-30

722

12,5.

3210

3,5 590 б

11

11а и

Свободные клетки о

-30

782

12 5,15

«tt

7650

3,5

160

«» «»

««О аа

Способы культивирования продуцентов РНКаз: стационарный режим - Рф 1а, б, г; Эа, в; 4а, б; 5а, в; 6б, в; 7а, б; 8а, в1 9а, б, 10а, 6 и 11а, в, культивирование в реакторе проточного типа - Ю 1в, 3б, 5б, 6а, 8б и 116.

Составитель А.Воробьева

Техред А.Кравчук

Корректор Л.Пилипенко едактор А.Кондрахина

Заказ 3092 .Тираж 489 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Условия иммобилизации с. спор концент- время рация замоПВС, Х P BXM= вания ч в

Свободные клетки время инкубации, сут. суммарная продуктивность (ед. акт/г суxoro мицелия)