Способ определения агглютинации энтеробактерий

 

Изобретение относится к микробиологии . Цель изобретения - повьппение точности и чувствительности. Суспензию энтероба |:терий смешивают с разведенной агглютинирующей сывороткой . Пробы анализируют на содержание агглютинатов энтеробактерий.Подсчитывают те агглютинаты, размеры которых 5 мкм или больше. Положительным результатом считают вариант, при котором количество агглютинатов при втором измерении превышает количество агглютинатов при первом измерении более, чем в 1,3 раза. Способ обеспечивает возможность регистрации реакции агглютинации на основе данных дисперсионного количественного анализа агглютинированной суспензии энтеробактерий.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (!9) (1!) А1 (51 )4 G 01 N 33/54

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСНОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

f10 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4109352/28-14 (22) 06,08,86 (46) 30.06.88. Бюл, У 24 (72) Н.P.Èèàíîâ, Д.В.Тупикин, Г.М.Шуб, К.А.Грачев и В.E.Ñîêîëîâ (53) 615.36 (088.8) (56) Жулин И.Б, и др. - Биофизика, 1984, т.29, В 5, (54 ) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АГГЛ10ТИНА. ЦИИ ЭНТЕРОБАКТЕРИИ (57) Изобретение относится к микробиологии. Цель изобретения — повыше" ние точности и чувствительности. Суспензию энтеробактерий смешивают с разведенной агглютинируюшей сывороткой. Пробы анализируют на содержание агглютинатов знтеробактерий.Подс" читывают те агглютинаты, размеры которых 5 мкм или больше. Положительным результатом считают вариант, при . котором количество агглютинатов при втором измерении превышает количество агглютинатов при первом измерении более, чем в 1 3 раза. Способ обеспечивает возможность регистрации реакции агглютинации на основе данных дисперсионного количественного анализа агглютинированной суспензии энтеробактерий.

1406488

Изобретение относится к медицинской микробиологии, касается вопросов серологического анализа и может быть использовано при диагностике инфек5 ционных заболеваний и идентификации бактерий.

Цель изобретения - повышение точ ности способа эа счет повышения чув ствительности определения, 10 !

Способ осуществляют следующим об1 разом.

Суспензию энтеробактерий (концент рация от 10 -10 микробных тел/мл) смешивают .с разведенной агглютинирую-15 ей сывороткой в объемных соотношениях 1 10. Целесообразно выбирать объемные соотношения, не превышающие соответственно 0,1 мл и 1,0 мл. При ,этом готовят две идентичные .пробы. 20 алее полученные пробы анализируют а содержание агглютинатов энтеро-! бактерий проточным фотоэлектрическим методом путем их количественного подсчета с помощью соответствующего 25

:,устройства. При этом первое измерение через 1-3 мин проводят сначала с одной пробой, а второе измерение

1 через 20-40 мин от начала реакции с другой пробой. Для анализа каждый 30

;раз отбирают строго постоянный объем пробы, Перед. измерением отобранный

:объем разводят ампульным физиологи ческим раствором так, чтобы разведение вновь полученной пробы было в

:10 раз больше исходной, После этого проводят регистрацию количества агглютинатов в 1 мл новой пробы. При этом подсчитывают только те агглютинаты, размеры которых достигли или превышают 5 мкм. Положительным результатом регистрации PA энтеробактерий считают вариант, при котором количество агглютинатов определен" ное при втором измерении превышает количество агглютинатов при первом, более чем в 1,3 раза. Во всех других вариантах результат PA считают отрицательным.

В предлагаемом способе величина бактериальных агломератов, регистрируемых как агглютинаты энтеробактерий ограничена по размерам нижним пределом, равным 5 мкм. Опытным путем получено, что в процессе агглютинации на начальной стадии реакции преобладающим размером, образующихся в пробе агглютинатов, является величина 7 5 мкм, что обусловлено слипанием (под действием сыворотки) 5-10 клеток энтеробактерий со средними размерами 1-1,5 мкм (верхний предел размеров регистрируемых агглютинатов не указывается, так как при использовании для постановки PA сывороток с высокой агглютинирующей активностью, отдельные агглютинаты могут достигать величины, при которой становятся различимы даже невооруженным глазом).

Вместе с тем, в анализируемой пробе, наряду с агглютинатами энтеробактерий, образующиеся в ходе PA возможно наличие спонтанноагглютинировавших бактерий. В неагглютинированных суспензиях энтеробактерий максимальные размеры спонтанных агломератов практически не превышают 5 мкм и их количество может колебаться на фоне общей бактериальной массы.

В силу указанных обстоятельств, с целью исключения артефактов при учете PA регистрируют только агглютинаты, размеры которых 5 мкм. При этом регистрация агглютинатов с размерами 5 мкм возможна, так как при повременном учете количество спонтанно агглютинировавших бактерий и других частиц (загрязнение) с этими размерами не будет существенно изменяться (экспериментально установлено, что максимальное изменение уровня спонтанной агглютинации в течение времени регистрации PA не превышает

1,3 раза). При подсчете агглютинатов допустимые значения отношений количества агглютинатов при втором измерении N(t g) к количеству агглютинатов при первом N(g1}, при которых возможен положительный учет PA должны быть выше 1,3. При всех значениях

N(,,) /И(1 „) 1,3 изменение количества агглютинатов в процессе PA стано" вится сравнимо с колебаниями уровня спонтанной агглютинации. В этом случае достоверность результатов не гарантируется, Регистрируют агглютинацию энтеробактерий при двух отсчетах времени. .Целесообразно проводить первое измерение в интервале 1-3 мин от начала

PA. Как известно, в течение первых трех минут протекает специфическая фаза реакции. При этом на первой ми" нуте агглютинации, как правило, не происходит - реакция характеризуется взаимодействием антител сыворотки с гомологичными антигенами энте3. 140 робактерий. Далее специфическая фаза сопровождается начальной агглютинацией бактерий. Через 3 мин специ" фическая фаза завершается — реакция характеризуется нарастанием количества агглютинатов в пробе. Второе измерение числа агглютинатов в пробе целесообразно г роводить через 20

40 мин от начала PA. Это обусловлено тем, что при использовании для постановки PA сывороток с низкими агглютинирующими свойствами (например, разведенной до титра) процесс нарастания количества агглютинатов в пробе значительно растянут во вре" меии. При этом за время 3 et<20 мин изменение (увеличение) числа агглютинатов в ходе PA может оказаться 1,3, что не позволяет отдифференцировать PA от колебаний уровня спонтанной агглютинации, С другой стороны, возможны случаи, когда через

40 мин количество регистрируемых агглютинатов может существенно снизиться, во-первых, по причине их укруп-нения с соответствующим уменьшением количества, во-вторых, в результате возможного эффекта обратимости PA при котором иэ-за нарушения оптимальности соотношений исходных ингредиентов РА, происходит перегруппировка агглютинатов, сопровождающаяся их частичным разрушением. В силу этих эффектов условие 1(t )/И(С „)o1,3 может быть нарушено.

Приготовление двух идентичных проб для повременного учета PA необходимо в целях исключения нарушения процесса агглютинации при отборе части пробы для измерения, так как при работе с одной пробой возможны нару" шения соотношения ингредиентов PA.

При этом искажается результат анализа.

Предварительное разведение исходной пробы перед измерением, обеспечивает разделение агглютинатов друг от друга и дает воэможность учета каждого из них в отдельности, а также позволяет преостановить PA и зарегистрировать мгновенную картину агглютинации в определенный момент времени.

Способ может быть реализован на серийно выпускаемом приборе класса

ПКЖ ..

Пример 1. Регистрируют агглютинацию бактерий рода Salmone11a.

Предварительно готовят две идентичные

55 денной 1:1600 ампульным физиологическим раствором. Через 1 мин одну из проб разводят в 10 раэ ампульным физиологическим раствором подсчитывают число агглютинатов в пробе проточным фотоэлектрическим методом.

Через 20 мин тем же путем проводят подсчет числа агглютинатов в другой пробе. Па отношению числа агглютинатЬв при первом измерении к числу агглютинатов при втором измерении делают заключение о регистрации PA (положительная).

П р н м е р 2. Регистрируют агглютинацию бактерий рода Salmonella.

Предварительно готовят две идентичные пробы, для чего берут по 0,05 мл стандартного сальмонеллеэного диагностикума — 0 (7) и добавляют по 0,5 мл агглютинирующей сыворотки к сальмонеллам группы С, разведенной 1:1600 ампульным физиологическим раствором.

Через 2 мин одну иэ проб разводят в

10 раз тем же физиологическим раствором и проводят подсчет агглютинатов.

Установка, на которой проводят измерения, и последовательность операций аналогична примеру 1. Через 30 мин проводят подсчет агглютинатов во второй пробе тем же путем. По соотношению числа агглютинатов при первом и втором измерениях делают заключение о регистрации PA (положительная).

Использование предлагаемого способа регистрации агглютинации энтеро" бактерий обеспечивает (по сравнению с известным) воэможность регистрации PA на основе данных дисперсионного количественного анализа агглютинированной суспенэии энтеробактерий.

При этом обеспечивается воэможность счета отдельных агглютинатов в потоке пробы, что позволяет увеличить чувствительность способа (в сравнении с известным) на 4«5 порядков.

Это дает возможность учитывать практически единичные агглютинаты, образующиеся в пробе в ходе PA что в сочетании с повременным учетом их количества позволяет существенно повысить точность (достоверность) регистрируемых параметров.

6488

4 пробы, для чего берут по 0>05 мл стандартного сальмонеллезного бактериального диагностикума — 0(7) и добавля5 ют по 0 5 мл агглютинируюшей сыворотt ки к сальмонеллам группы С, развеСоставитель П,Бонарцев

Техред М.Ходанич Корректор В.Бутяга

Редактор А.Ревин

Подписное

Тираж 847

Заказ 3185/39

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г."Ужгород, ул. Проектная, 4

5 1406488 6

Предлагаемый способ (в отличие от агглютинации посредством измерения известного) позволяет проводить экс- светорассеяния в пробе, о т л и— пресс-оценку агглютинации энтеробак- ч а ю шийся тем, что, с целью терий, так как обеспечивает возмож5 повышения чувствительности и точносность получения результатов PA в те- ти, регистрацию проводят проточным чение 20-30 мин. фотоэлектрическим методом путем подсчета числа агглютинатов с раэмераФ о р м у л а и э о б р е т е н и st ми 5 мкм и вьппе дважды через 1-3 и

Способ определения агглютинации 10 20-40 мин от начала реакции и при энтеробактерий путем обработки сус- увеличении числа более чем в 1,3 рапензии агглютинирующим реагентом с за определяют агглютинацию .энтеро" последующей регистрацией микробной бактерий.