Способ получения антибиотика 6270

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК СЕ®у

g г. р .« f

"« 4МО 7@(ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3892105/28-13 (22) 12.04.85 (31) 729)2/)984 (32) 13.04.84 (33) JP (46) 07.07.88. Бюл. У 25 (71) Какен Фармасьютикал Ко. Лтд (JP) (72) Йоко Касукабе, Нобуко Такахаси, Акио Сейно и Ясуо Ивагайа (JP) (53) 615.779.9(088.8) (56) Патент СССР )1" 673184, кл. С 12 P 1/02, 1979.

Заявка Франции 1) 2164792, кл. А 61 К 21/00, 1973. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА

6270

„„SU „„1409132 51> 4 С 12 P 1/06//(С ) 2 P 1/06, С 12 R ).:01) (57) Изобретение относится к новому антибиотику 6270, к способу его получения и применения в качестве антикокцидиозного средства или в качестве пищевой добавки для ускорения роста домашних животных и птицы. Целью изобретения является выделение микроорганизмов, обладающих антибиотическими свойствами. Способ заключается в культивирований штамма Nocatdiopsis

sp FERN ВР-717 на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли при температуре

30 С в течение 96 ч с последующим выделением и очисткой целевого продукта. 4 табл.

1409132

Изобретение относится к новому антибиотику 6270, к способу его получения и применения в качестве антикокццдиозного средства или в качестве пищевой добавки для ускорения роста домашних животных и птицы.

Целью изобретения является выделение микроорганизмов, обладающих антибиотическими свойствами.

Штамм Nocardiopsis sp. 6270 депонирован в Исследовательском ферментационном институте Японии под номером

FFRM ВР-717., 11орфологические характеристики.

Субстратный мицелий хорошо развит и разветвлен, поэтому ширина каждого мицелия составляет примерно 0,4 мкм.

Воздух ый мицелий хорошо растет в некоторых культуральных средах, таких20 как сахарозо-нитратная агаровая культуральная среда (Дифко. Агаровый раствор Чапека), крахмальная агаровая культуральная среда (Т S Р-4, Дифко-Неорганический солевой крахмальный агар), культуральная среда овсяная мука — агар (I S P-8) или глюкозо-аспарагиновая агаровая культуральная среда. Воздушный мицелий является прямым или искривленным и внешний вид колонии паутинистый (в целом они образуют паутину). При созревании воздушный мицелий имеет ширину от 0,4 до 0,6 мкм. У стареющей колонии через 10 дней после начала

35 культивирования воздушный мицелий подвергается фрагментации и образует длинные споровые цепи, каждая из которых содержит по крайней мере

10 спор Споровые цепи не являются 40 спиральными. Поверхность спор гладкая, споры имеют цилиндрическую форму. Их размер составляет примерно

0,4 ° 1,2 мкм, Нет спорангия, наблюдаются склероции или синнемы. 45

Куль туральные характеристики.

Тесты проводят в соответствии с общепринятым методом испытаний.

Цвет определяют под стандартным источником освещения ксеноновой лам50 пой.

Приведенные ниже данные относят к условиям роста при культивировании о в течение трех недель при 28 С на агаровой пластинчатой культуральной среде. Показатель а указывает рост, 55 пжазатель Ь указывает состояние воздушного мицелия, показатель с указы" вает растворимый пигмент и показатель d — наличие других характеристик.

Сахарозо-нитратная культуральная среда (Агаровый раствор Дифко-Чапека): а) хороший, сероватый,(2 ва);

Ь) белый, порошкообразный; с) нет.

Глюкоэо-аспарагиновая культуральная среда: а) хороший, светло-желтый (Çic) до бежевого (3ge);

b) сероватый (Зва); с) нет.

Глицерино-аспарагиновая культуральная среда: а) слабый, (2ва);

Ь) слабое образование; с.) нет.

Крахмало-агаровая культуральная среда: а) отличный, 3 ic до Shale (Зса);

Ъ) белый порошкообраэный; с) нет;

d) гидролиз крахмала: отрицательно.

Тирозно-агаровая культуральная среда. а) слабый (3ge)

b) нет; с) нет.

Питательная агаровая среда (Дифко, Бакто-питательный агар):

a) слабый, светлая пшеница (2еа)

b) нет; с) нет.

Дрожже-солодовый экстракт агаровая культуральная среда: а) отличный, трещины (cracks) топаз (3ne);

b) белый; с) нет.

Культуральная среда с овсяной мукой: а) хороший, оболочка (shel 1) (2са);

Ь) 2 Ъа; с) нет.

Физиологические характеристики.

Интервал температуры роста. Не наблюдают рост ниже 5 или выше 39,5 С.

Оптимальная температура 27-38 С.

Разжижение столбика глюкозо-пептоно-желатиновой культуры: поло;кительно.

Гидролиэ крахмала: отрицательно.

Коагуляция и -пептонизация снятого молока: нет коагуляции и существенной пептонизации (37 С).

3 1409

Образование меланина: ISP — тироэиновая агаровая культуральная среда; отрицательно; ISP — тирозиновая культуральная среда с бульоном дрожжевого экстракта: отрицательно; ISP — пептоно-дрожже-железистая агаровая культуральная среда: отрицательно °

Толерантность NaC1: нет роста при

4Х и выше.

Растворимость ксантина, гипоксантина, аденина: отрицательно.

Использование источника углерода (баэальная среда Прайдхэма и Готтлиба) .

Положительно: D-глюкоза, Ь-арабиноэа, D-ксилоэа, салицин.

Слабо положительно: D-фруктоэа, caxaposa.

Отрицательно: иноэит, Ь-рамноэа, раффиноза, D-маннит.

Штамм 6270 идентифицируют как штамм, принадлежащий к Nocardiopsis

Мейер 1976 среди октиномицетов, так как наряду с упомянутыми различными характеристиками он образует длинные цепи спор в воздушном мицелии, а гид- . ролизат целых клеток содержит мезодиаминопимеровую кислоту и галактоэу, но не содержит арабиноэы и мадурозы, кроме того не определяется миколевая кислота °

При осуществлении способа микроорганизм, продуцирующий антибиотик

6270, культивируют в соответствии с традиционными методиками культивирования известных актиномицетов. Однако с промышпенной точки зрения выгодно применять метод культивирования с аэрацией — перемешиванием. В

40 качестве культуральной среды для продуцирования могут быть применены материалы, обычно используемые для культивирования актиномицетов. А именно могут быть использованы в подходящих сочетаниях различные источники углерода, источники азота и органические и неорганические соли, а также противовспенивающий агент при необходимости. Температура культивиро50 вания обычно лежит в интервале от 25 о о до 35 С, предпочтительно около 30 С.

Время культивирования может меняться в зависимости от различных условий.

Однако обычно накопление продуцированного антибиотика 6270 достигает

55 максимума через 72-148 ч.

Антибиотик 6270 может быть выделен из культуральной среды и очищен

132 4 при использовании его физико-химических свойств с помощью традиционных методик, таких как метод использования различия в растворимости примесей, метод использования различий в адсорбции ионообменными смолами или различными адсорбирующими агентами, метод экстракции органическим растворителем, не смешивающимся с водой, или же сочетание различных средств, таких как осаждение, удаление примесей, диализ, сушка и перекристаллиэация.

Например, антибиотик 6270, полученнйй в культуральной среде, извлекают следующим образом. После добавления фильтрующей добавки, такой как диатомитовая земля или Радиолит

700, культуральный бульон фильтруют и фильтрат и микробные клетки соответственно экстрагируют подходящими растворителями, такими как этилацетат и ацетон. Затем объединяют клеточный экстракт и экстракт из фильтрата ° Отгоняют растворитель из этого экстракта, в результате получают антибиотик 6270 в виде сырых кристаллов, сырые кристаллы подвергают, например, хроматографии. Элюат концентрируют при пониженном давлении, а остаток растворяют в подходящем растворителе, таком как этилацетат, а затем обрабатывают разбавленной соляной кислотой. Слой растворителя концентрируют, в результате антибиотик 6270 кристаллизуется в виде свободной кислоты.

Для получения натриевой соли упомянутый слой растворителя обрабатывают разбавленным раствором соляной кислоты, а затем разбавленньс раствором .карбоната натрия, слой растворителя концентрируют, в результате получают антибиотик 6270 в виде натриевой соли. Полученный таким образом антибиотик 6270 в. виде свободной кислоты или натриевой соли может быть перекристаллизован из подходящего растворителя, такого как н-гексанэтилацетат, чтобы получить чистые кристаллы. Антибиотик 6270 в виде свободной кислоты обладает следующими свойствами.

Бесцветные иглоподобные кристаллы, кислотное вещество.

Точка плавления: 115-118 С.

Элементный анализ найдено,7:

С 62,72; Н 9,49; О 27,78.

5 1

Удельное вращение: (g) — 11,5 (С 1,0, метанол).

УФ-спектр поглошения.

Не наблюдается максимумов полос поглощения при 210 нм или более при измерении метанольного раствора.

Характеристические полосы поглощения (см- ) в ИК-спектре (таблетка с бромистым калием): 3470, 2980, 2945, 2890, 1735, 1460, 1380, 1315, 1165, 1102, 1075, 987, 980.

Растворимость: растворим в метаноле, этаноле, этилацетате, хлороформе, эфире, ацетоне и бензоле, нерастворим в воде.

Цветные реакции, положительно в реакции с ванилином — серной кислотой и в реакции Драгендорфа; отрицательно в реакции с нингидрином; окраска с 1 газообразным.

Тонкослойная хроматография: (на

254 кизельгуре GF производимом фирмой Мерк Ко):

Система растворителей Величина R

Хлороформ:метанол(20:1) 0,49 н — Гексан-этилацетат(1:1) 0,08

Бензол"этилацетат (1:1) 0,04

Хлороформ- ацетон (2:1) 0,36 н-Гексан-этилацетат (1:3) 0,13

Этилацетат 0,22 Н-ЯМР-спектр: наличие трех метоксигрупп наблюдается при l ппм

3,39 (ЗН), 3,49 (6Н ), спектр снят при 100 МГц в тяжелом хлороформе с испо,пьзованием TNC в качестве внутреннего стандарта.

1 С-ЯМР-спектр: результаты измерений при 25 МГц в тяжелом хлороформе ТМС в качестве внутреннего стандарта. Согласно этим результатам общее число атомов углерода равно 44.

Антибактериальный спектр приведен в табл.l. Антибиотик 6270 обладает особенно сильными антибактериальными свойствами против грамположительных бактерий и является полезным как антибактериальный агент.

В низких концентрациях он обладает антикокцидиозной, акарицидной и противовирусной активностями и является полезным как антикокцидиозное средство для домашней птицы, такой как куры, перепела, утки, гуси и индейки, и для домашних животных, таких как коровы, свиньи, кролики, буйволы, козы и овцы, в качестве агента для лечения диарреи домашних живот409132 ных или в качестве агента для увелиI чения эффективности п тания или для ускорения роста домашних животных и птицы, 1

Пример 1. Засевают 1 л культуральной среды (рН 6,0), содержащей

6,0Х глюкозы, 2,0Х соевой муки, l OX

torula дрожжей и 0,5Х карбоната кальция, штаммом Nocardiopsis sp. 6270 о (FERM ВР-717) и культивируют при ЗОС

48 ч. Этим культуральным бульоном засевают 100 л культуральной среды, имеющей указанный состав, и культивируют при 30 С в течение 96 ч при перемешивании в аэрации в сосуде,имеющем емкость 200 л. Скорость аэрапии составляет 100 л/мин, а скорость вращения мешалки равна 250 об/мин. После добавления фильтрующей добавки (Радиолит 700) этот культуральный бульон фильтруют для разведения фильтрата и клеток. Затем фильтрат экс трагируют 40 л этилацетата, а клетки экстрагируют 30 л ацетона. Ацетоновый клеточный экстракт концентрируют при пониженном давлении для удаления ацетона и экстрагируют 20 л этилацетата. Этот экстракт объединяют с экстрактом из фильтрата и объединенный раствор концентрируют при пониженном давлении. Остаток адсорбируют на колонке, заполненной 750 г силикагеля (Вако-гель С-200) с хлороформом, и через колонку пропускают смесь хлороформа и метанола (100:1). Активную фракцию концентрируют при пониженном давлении досуха, в результате получают маслянистый остаток. 3атем остаток растворяют в небольшом количестве ацетона и адсорбируют раствор на колонке с Сефадексом LH-20, заполненной ацетоном, и элюируют ацетоном. Полученную таким образом активную фракцию концентрируют для получения сырых кристаллов антибиотика

6270. Кристаллы растворяют в э гилацетате и встряхивают с разбавленной соляной кислотой. Этилацетатный слой концентрируют при пониженном давлении. Образовавшиеся кристаллы перекристаллизовывают из смеси н-гексана и этилацетата, в результате получают

23,4 г свободной кислоты антибиотика 6270 в виде бесцветных иглоподобных кристаллов. Полученная таким образом свободная кислота антибиотика

6270 обладает упомянутыми физико-хи1409132 мическими и биологическими характеристиками, Пример 2. Антикокцидиоэная активность.

Антибиотик 6270 однородно смешивают со сложным кормом для кур, чтобы получить заранее определенную концентрацию. Полученный таким образом корм свободно поедается курами в течение двух дней до инокуляции ооцитами и до конца испытания (восемь дней после заражения).

Для сравнения используют Моненсин, который является известиным антикокцидиозным препаратом, Используют цыплят в возрасте 7 дней, которых содержат в условиях полного предохранения от кокцидиоэной инфекции по 5 в группе.

Ооциты, использованные для заражения, представляют собой чувствительный штамм Eimeria tenella. Каждому цыпленку инокулируют полностью выросшие ооциты (3 10 ) орально с ис4 пользованием металлического зонда.

Результаты представлены в табл.2.

Эффект от применения средства определяют по Антикокцидиальному Индексу (АСТ), который рассчитывают по следующей формуле:

ACI (Относительное увеличение веса + доза выживания)-(ооцитная величина + показатель заболеваемости);

120 или менее: как антикокцидиозный агент неэффективен;

160 или менее: слабо эффективен;

160-180: умеренно эффективен;

180 или выше: очень эффективен. (i) Относительное увеличение веса.

В конце испытания определяют увеличение веса (а именно вес в конце испытания — вес во время заражения) каждой испытуемой группы и вычисляют относительное увеличение веса на основе веса контрольной группы(100), которая не получает антикокцидиозное средство. (11) Ооцитовый индекс, Число ооцитов в слепой кишке подсчитывают через Ц дней после заражения путем гомогенизации кишечного канала. Ооцитовый индекс определяют следующим образом.

Число ооцитов, най- Ооцитовый инденных в кишечном декс канале

0,0-0,! !О 0

0,!†!,Π10 1

1,0-5,0 10 10

5 0-11,0 ° 10 20

) 11,0 ° 10 40 (i i i) Показатель заболеваемости кишечного канала.

Испытуемых цыплят анатомизируют в конце опыта (8 дней после заражения) и исследуют кишечный канал не10 вооруженным глазом, чтобы определить пдкаэатель заболеваемости. Показатель заболеваемости определяют, как приведено ниже, а величина заболеваемости была определена в десять раэ, так же как и величина показателя эаболеваемости.

О,(-) Кишечник совершенно нормальный. Если найдено пятно крови, (-) меняется на (+), 1,(+) Кишечник нормальный по форме. его содержимое слегка жидкое и желтоватое. Обнаруживается слабое набухание частично на слизистой мембране кишечника, который становится

25 беловатым.

2,(++) Кишечник обычно нормальный по форме. Набухание наблюдают на всей поверхности сяизистой мембраны. В содержимом крови не найдено. Слизь слегка желтоватая и поблекшая. На слизистой мембране обнаружено немного белых некротических пятен или кровяных пятен.

3,(+++) Кишечник заметно усох и

35 изменен по форме, он немного длиннее, чем прямая кишка. Содержимое совершенно аномально и часто кишечник заполнен свернувшейся кровью или белосерым, творогоподобным перерожденным

40 веществом. Стенка кишечника заметно набухшая и легко рвется, а иногда еще остаются пятна крови. Болезнь затрагивает основание кишечника, но не прямую кишку.

45 4,(++++) Усыхание и деформация кишечника являются значительными. Кишечник выглядит подобным колбасе по форме и не длиннее прямой кишки. Болезнь поражает треть или четверть прямой кишки.

Группы 1-3 получают. корм, содержащий заранее определенную концентрацию антибиотика 6270, начиная за два дня до инокуляции ооцитов. Группа 4 для сравнения получает корм, содержащий антибиотик Моненсин. Группа 5 представляет собой зараженную, не получавшую лекарства контрольную

1409! 32 группу, инокулированную ооцитами.

Группа 6 представляет собой незараженную контрольную группу, не получавшую лекарства.

Из этих результатов испытаний видно, что антибиотик 6?70 обладает антикокцидиоэной активностью.

Пример 3. Тест на эффективность корма на свиньях. 10

Используют свиней пород Land.

Основной корм: а) с начала испытания до четырех недель: 607 зерна (кукуруза, пше.ница, ячмень), 15% соевого жмыха, 15Х корма животного происхождения (порошок снятого молока, рыбная мука), и 10% другого (ферменты, карбонат кальция, фосфат калия, хлористый натрий и др.); б) от 4 до 12 недель: 78% зерна 20 (кукуруза, ногоплодник ржавый, пшеница), 13% соевого жмыха, 57 рыбной муки и 47. других (карбонат кальция, фосфат кальция, хлористый натрий и т.п.) .

Методика.

Разделяют на три группы 15 поросят 35-дневного возраста, в каждой группе по пять свиней, таким образом, чтобы сред1п1й вес был одинаковым.

Антибиотик 6270 добавляют к основному корму в количестве О, 12.5 и 25 млн долей (ппм) соответственно. Три группы свиней кормят кормами соответственно 12 недель. Затем измеряют вес З5 тела и потребление корма.

Далее подсчитывают общее число дней, во время которых свиньи страдали от диарреи в течение четырех недель от начала испытания. Резуль- 40 таты приведены в табл.3

Показатель потребности в пище улучшается на 5-87 при кормлении кормом, содержащим антибиотик 6270, Пов;.пление веса улучшилось на 5-11%. 45

Кроме того, наблюдается, что диаррея у свиней существенно снизилась.

l0

Пример 4. Зффек гивнос г.. корма у жвачных.

Используют бычков породы Гольштейн.

Концентрированный корм: 71,57. эерна (кукуруза, ногоплодник ржавый)

miro (ячмень) 11,5% мякины и отрубей (кормовая клейковина кукурузы, пшеничные отруби, масляный жмых рисовых отрубей), 5,57 жмыха растительных масел (соевый жмых, жмых от льняного масла) и ll 5% другого (арахисовая мука, меласса, фосфат кальция, хлористый натрий).

Методика.

15 кастрированных бычков в возрасте 8 месяцев разделяют на три группы по пять бычков в каждой таким образом, чтобы средний вес был одинаковым. Добавляют антибиотик 6270 к основному концентрированному корму в количестве 0,7,5 и 15 ппм соответственно. Три группы бычков кормят этими кормами соответственно. Кроме того, высушенную рисовую солому скармливают в качестве сырого корма в количестве 1 кг на бычка. Результаты показаны в табл.4.

Показатель потребности в концентрированном корме улучшается на 7-10% при кормлении кормом, содержащим антибиотик 6270. Прибавка веса увеличивается на 9-11%.

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

Способ получения антибиотика 6270, обладающего противококцидиозным действием, з;:ключающийся в культивировании штамма Nocardiopsis sp„FFRM

ВР-717 на питательной среде, содержащей источник углерода, азота и минеральные соли при 30 С в течение о

96 ч с последующим выделением и очисткой целевого продукта.

1409132

Таблица!

МинимальКультуральная среда

1,56

1,56

6,25

1,56

3,13

6,25

6,25

100

100

> 100

100

100

1,56

1,56

3,13

Ь

> 100

0 100

12,5

) 100

)100

Тест-микроорганизм

Bacillus cereus IAM-1729

Васillus cerculans IFO 3329

Bacillus subtilis PCI 219

Micrococcus flavus IFO 3242

Sarcina lutea NIHJ

Staphylococcus aureus

FDA 209PJC-1

Staphylococcus aureus (устойчив к пенициллину, стрептомицину, хлорамфениколу,, тетрациклину H канамицину) Esherichia coli NIklJ JC-2

Escherichia coli (устойчив к стрептомицину, канамицину, хлорамфениколу и тетрациклину) Klebsiella pneumoniae PCI 602

Proteus vulgaris OX-19

Pseudomonas aeruginosa IFO-3756

Mycobacterium smegmatis ATCC 607

Mycobacterium avium IFO 3153

Mycobacterium phIei NIHJ

Penic ill ium chrysogenum 0-176

Aspergillus flavus ATCC 9643

Cochliobolus miyabeames

Alfernaria mari

Candida albicans YU 1200

Saccharomyces cerevisiae

Strain 77 ная ингибирующая концентрация, мкr/ìë

1409132

l4 о о

Ю Ф е е

@Ъ л о е г л в о а л

Ф л

D

8 о

an

»» о cv o ю о о о п

В

+ и х а о ч о ч о

О фФЪ

-а о

Ю O л ч о х Ф ф Cl

O l CI окм х о

9 о о 6 о

Ю сч л

cv

Ю л

CY. Ъ

Ю CV и

М

t

Ф и

1 о !

I . + л

1 со

+ 1

t +

1 л +

1 + !

Ф 1 о и а к

4 х ю

Ф g

Цх

v x

+ I +

1 +

t 4

1 +

an 1 Ф ! о

1 I + о и

ko а е о,е

Ф»

РЪ е» о о со

° ь ф

Ch л

Ю л

%O мЪ в

an O

CV ф

Я 1

6 6 - 6

Фй о ! и(:к 0à ê о е о Ф

1 1

» еч о !

I о о

r сч сч

° О О а Ф

1 С» М и)к 1О Ф CV е о о cc o

О О О О МЪ о о О о !ч

1 1 I I, и. Я, 1

» ° и

Я

Ь !!

I и

° ф и

В. и

° а

Ю т

Э

140с 132

Таблица3

Группа диий в иа

Среднее количестиндекс лотребиости в корке е

Улучвевне иие средго веsa neе исво корма, съедеяиого во время испыдеаса потребности в кормв а а аяия, кг од,кг таяна>аг

1 12,S 8,20 45,82

106,9 2, 333 3,0 13/ 140

2 2$

7,18 48,30 110s1 2,280 7,2 Э/140

3 0 8,2Э 43,73 107,4 2,456 — 48/!40

Средяее количество корма, съеденного i во время периода испытаяий

Ф

Показатель потребиости лини

Средяее увеличеиие веса во ерема периода испмтаиий

Покааатель потребности в пюаеа когда был добавлен 6267

Показатель потребности в пине,когда ие был добавлея аятибяотик

Улкчвеиие показателя потребиости в пще, X

Таблица 4 оличесто антибиоика 6270 обавленого в орм (ппн) Показатель потребности в кон

Гpynпа

Средний вес в наСредний привес

sa период, xr чапе исцентрированном корт пытания, кг

2310

9,2

320

7,5

7,8

2360

318

3l0

2320

281

323

Среднее количество кормаа съеденного во время испытаний

Показатель потребности в хонцентрироваинон корне

Средняя прибавка веса sa время испытаний

+ Улучиение показателя потребности в концентрированном корне

Показатель потребности в корме когда прибавлен 6267

Показатель потребности в корне, когда не добавляли антибиотик

Сос тави тель Г. Марченко

Корректор М.Максимишинец

Редактор А.Воровнч

Тираж 520 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изОбретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 3362/58

Производс;венно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Количество аятибио6270,добавлея" яое ° корм (ллм) Среднее количество концентрированного корна,съеденного за период испытаний,кг

7,500

7,618

8,256

Обяее число диеЯ, когда калдал группа страдала от диарреи обms e число диеЯ во время испытаний аидоЯ группы

Улучюение показателя потребности в концентрированном корме,. Й