Способ определения гексозаминов в медицинских препаратах

 

Изобретение относится к биохимии и фармакологии. Цель изобретения -повЫшение точности и упрощение способа. После отбора пробы препарата проводят ее гидролиз соляной кислотой при 115- 120°С. Гидролизат нейтрализуют раствором едкого натрия до рН 6,0-8,0. Проводят отбор нейтрализованного гидролизата, в который вводят раствор ацетилацетона в бикарбонате натрия . Смесь после нагревания охлаждают . К гидролизату добавляют этиловый спирт, парадиметиламинобензальдегид, концентрированную соляную кислоту и этанол. Затем определяют количественное содержание гексозаминов. Способ применим для определения кератансульфата из роговицы глаза и гликозаминогликанов, выделенньгх из 12-перстньЕХ кишок свиней. S

СОЮЗ СОНЕТСНИХ

СООИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (19) (11) (51) 4 G 01 И 21/17, 21/78

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4052271/28-14 (22) 07.04.86 (46) 23.11.88. Бюл. и - 43 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт мясной промьпппенности (72) Л.К.Барткова, И.В.Исаева, Т.Н.Орлова и Е.Ю.Куликова (53) 612.015 (088.8) (56) Бычков С.М., Колесникова М.Ф.

Биохимия, 1966, т.31, В 3, с. 533. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕКСОЗАМИНОВ

В МЕДИЦИНСКИХ ПРЕПАРАТАХ (57) Изобретение относится к биохимии и фармакологии. Цель изобретения — по- вьппение точности и упрощение способа.

После отбора пробы препарата проводят ее гидролиз соляной кислотой при 115120 С. Гндролизат нейтрализуют раствором едкого натрия до рН 6,0-8,0.

Проводят отбор нейтрализованного гидролизата, в который вводят 1,5l раствор ацетилацетона в бикарбонате натрия. Смесь после нагревания охлаждают. К гидролизату добавляют этиловый спирт, парадиметиламинобензальдегид, концентрированную соляную кислоту и этанол. Затем определяют количественное содержание гексозаминов. Способ применим для определения кератансульфата из роговицы глаза и гликозаминогликанов, выделенных из 12-перстных кишок свиней.

1439476 путем введения этилового спирта в объемном соотношении к гидролиэату

1: 10 и смеси парадиметиламинобензальдегида, концентрированной соляной кислоты и этилового. спирта, которые берут в соотношении 0,08:1: 1,5 (реактива Эрлиха). Количественное содержание гексоэамина в медицинских препаратах определяют по следующей формуле: где С

100. Предлагаем» и способ определения содержания гликозаминогликанов в Ме дицинских прег аратах может быть схе-. матично представлен в следующем виде:

Гидролиз, соляной кислотой

DCHDB О дббб ВУВббгГ щества до гексоаамина 115-1i0 С б б В ВР б Пб б Я нейтрализа- . 1,57.- ного раствора ванного глд- адетнлацетона ролнза в бикарбонате натрия

ПВбг pall l ptpm н дб б раствором е1псого патра до слабсбцелочной реакции — д Нагревание

07, 1 С вЂ” Обдбддббд д бб Ю. до 20 g 1 0 этн;Воного спирта 1: 10 — Колориметрированна при

530 ки. Добавление реактива

Эрлиха

Для каждого гликолротеина установлены оптимальные условия гидролиза.

Эта необходимость объясняется тем, что устойчивость к кислотам данной гликоэидной связи зависит оТ природы сахаров, участвующих в образовании ср.ÿýè, и от положения связи по отно- шению к агликону.

В предлагаемом способе такими ollтимальными условиями явх1яются: для гепарина и гликозаминогликанов, выИзобретение относится и биохимии и фармакологии, а именно к определению содержания гексозаминов в медицинских препаратах содержащих гли1 5 козаминогликаны в качестве основного фармакологически активного компонента, и можеть быть использовано при контроле качества препаратов и для установления влияния отдельных технологических операций на выход этих ! биологически активных компонентов в препаратах. Кроме того, этот способ может быть использован при проведении диагностики заболеваний, связан- 15 ных с нарушением обмена этих соедине ннй.

Цель изобретения — повышение точности и упрощение способа за счет со:<ращения числа трудоемких операций.20

Способ осуществляется следующим образом.

После отбора пробы препарата проводят ее гидролиз соляной кислотой при 115-120 С, полученный гидролизат 25 нейтрализуют раствором едкого натра до рИ 6,0-8,0 и проводят отбор нейтрализованного гидролизата, в который вводят 1,57. — ный раствор ацетилаll; òoïà в бикарбонате натрия H далее 30 о смесь нагревают до температуры 97+1 С и охлажда1от до температуры 20 + +1 С,затем осуществляют цветную реакцию !

0тбор пробы ренарата

ДВ

1. Отечественная промышленность для медицинских целей выпускает следую50 щке препараты, содержащие гликозаминогликаны в качестве фармакологически активного компонента: стекловидное тело (гиалуроновая кислота), гепа.рин, хонсурид .(хондроитинсульфат).

Спосоо применим для определения кера55 тансульфага роговицы глаза и гликозаминогликанов. выделеш1ьух из двенадцатиперстных кишок свиней. количество гексозамина в

1 мл, найденное по калибровочному графику, мг; навеска препарата, мг; объем нейтрализованного гидролизата, мл; объем разбавленного гидро" лизата перед нейтрализацией у мл1 объем гидр лизата, взятый для нейтрализации, мл; объем нейтрализованного гидролизата, взятый для реакции, мл; множитель для перевода, X.

Количественное определение основного дсйствукнцего вещества по калибровочной кривой и формуле.

1439476 деленных из дненадцатиперстных кишок свиней-гидролиз 4 и, соляной кислотой в течение 3 ч при 115 С; для хонсурида (хондроитинсульфат) те же ус5 ловия, но температура гидролиза 120 С; для кератансульфата из роговицы глаз животных-время гидролиза 18 ч, температура гидролиза 120 С; для стекловидного тела (гиалуроновая кислота)— о время гидролиза 3 ч при 118 С.

Пример 1. Проводят отбор пробы препарата гепарин — 10 мг (точная навеска), Отобранную пробу количественно переносят в пробирку с притертой пробкой. Прибавляют 5 мл 4 н.соляной кислоты. Пробирку плотно закрывайт и нагревают н термостате при

115 С в течение 3 ч, 5 мл полученного гидролизата количественно перено- 2О сят в мерную пробирку вместимостью

10 мл. Довоцяf объем гидролизатора водой до 10 мл (V ). 5 мл полученного раствора (Ч ) нейтрализуют до рН 6,0 по О, 1%-ному раствору метилро- 25 та или по универсальной индикаторной бумаге, прибавляя вначале 2,4 мл 4 н. раствора едкого натра, а затем 2 капли 0,1 н, раствора едкого нат: а. Отмечают конечный объем нейтрализован- 30 нога гидролизата н пробирке (U<) . К оставшимся 5 мл раствора прибавляют

2,4 мл 4 н, раствора едкого чатра и

2 каппи 0,1 н, раствора ецкc;fо натра.

Из каждой пробирки отбг.рают по 1 мл нейтрализованного .-идролизата (V<) и помещают н высокие гробирки:-.местимостью 25 мл с притертыми пробкаж« и доводят объем растнора водой до

2 мл, прибавляют по 2 мл раствора «О ацетилацетона, Прсбирки закрывают и

„о помещают на водяную баню 97 + +1 C на

20 мин. Бо избежание испарения ацетилацетона верхний конец пробирок должен быть значительно выше уровня воды, Быстро охлаждают раствор дс комнатной температуры и прибавляют до 20 мл этилового спирта 95% тщательно перемешивают и приливают по

2 мп смеси парадиметиламинобензальдегида, концентрированной солянойкислоты и этилового .спирта 0 08: 1: 1.5 (реактив Эрлиха). Содержание проб рок тщательно перемешивают для удзления пузырьков углекислого газа.

Через 45 мин измеряют оптическую плотность растворов на фотоэлектроколориметре с максимумом поглощения при 530 нм н кювете с толщиной слоя см. Измерение проводят против контр;.льный пробы, Контрольную пробу го товят OJIнонременно с опытной: в пробирку с притертой пробкой помешают

2 мл Bopbl и 2 мл раствора ацетилацетона. Пробирк закрывают и помещают на водяную баню 97 + 1 C на 20 мин.

Далее проводят определение как описаго, На фотоэлектрокалориметре находят разность между оптической плотностью опытной пробы и оптической плотностью контролъноь пробы, она составляет 0,364. По калибровочному граЬику. построенному при использовании раствора стандартного образца гексозамина, нахсцят количество гексоза- мина н 1 "л пробы, оно составляет

О, 113 мл.

Содержание глпкозаминоглпхонов (по

Гексозам««ну) н пйепарате Гепарин н процентах (Х) определяют по формуле

l00 %, где С=0,1 :3ìã; U, = 7,6мп;

10 мл; =- 10 мг," = 5 мл; V мл, х 17, П р и е р 2. Проводят отбор про. бы препарата хонсурид — i 0 мг (точная нанеска) . Да.«с-е П0СтуПают,. КаК оПИСано в примере 1, за исключением того, что температура гидролиза 120О С H объем нейтрализованного гидрслизата, взятый«для реакцп: . G,5 мл (Ч, ) . .На

ФЭКе находят разность между оптичесYoé плотностью опытной пробы H 0IITH чесхой плот постыл коптрольноЙ пробы, она составляет 0,278. По калибровочному графику находят количество гексозамина в 1 мл пробы оно составляет 0,0860, Содержание хондроитинсульфата н препара-.е хонсурид (по гексозамину) определяют по формуле и î «о составляет 26 -20%.

Пример 3. Проводят отбор пробы препарата с "екловидное тело - 4 мл препарата. Далее поступают, как описано н примере 1, за исключением того, что гидролиз проводят -4 мл 8 н. раствора соляной к;-;: IoTbI при 118 С, после нейтр лизации объем нейтрал.;зованно-о гидрол««эата доводя" до 10 мл (V. ), объем нейтрализованного гидроль=-ата, взятый для реакции, 2 мч (, ) . На

ФЭКе находят разность между оптичес " кой плотностью =пышной пробы и oIITH

14394

С ° Ч< V — — — — -- ° 100, Ч4

15 где Х

Формула изобретения ч<

Составитель Н.Гуляева

Техред Д. Олийнык Корректор В.Романенко

Редактор С.Патрушева

Заказ 6069/42

Тираж 847 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб, д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ческой контрольной пробы, она составляет О, 168, По калибровочной кривой находят количество гексоэамина в 1мл прооы, оно составляет 0,052. Содержание гаилуроновой кислоты (по гексозамину) в препарате стекловидное тело определяют по формуле и оно составляет 13,1%.

В сравнении с известным способом, продлагаемый способ проще (отсутствует стадия отгонки 2-метилпиррола) и обладает более высокой точностью (о<иибка определения 0,827., в известном способе - 30%).

Способ определения гексоз аминов в медицинских препаратах путем отбо- 2п ра пробы, препарата, гидролиза соляной: кислотой, нейтрализации, добавления к гидролизованной пробе ацетилацетона, приготовленного на карбонате натрия, нагревания, охлаждения, добав- 25 ления реактива Эрлиха и этилового спирта с последующим колориметрированием, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и упрощения способа за счет сокращения 30 числа трудоемких операций, гидролиэ о проводят при температуре 115-120 С, 76 6 используют 1, 5%-ный< раствор апетипацетона в бикарбонате натрия, к гидролизату дополнительно добавляют этиловый спирт в объемном соотношении

1:10, используют реактив Эрлиха, содержащий п-диметиламинобенэалhpегид, концентрированную соляную кислоту и этанол в объемном соотношении 0,08:

:1:1,5, при этом количественное содержание гексоэаминов определяют по формуле содержание гекс оэ аминов, Ж; количество гексозамина в

1 мл, найденное по калибровочному графику; навеска медицинского препарата, мг; объем нейтрализованного гидролиэата, мл; объем разбавленного гидролизата перед нейтрализацией, мл; объем гидролиэата, взятый для нейтрализации, мл; объем нейтрализованного гидролизата, взятый для реакции, мл.