Способ получения ноурзеотрицина

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано при производстве антибиотиков. Цель изобретения - повышение концентрации целевого продукта , в культуральной жидкости. Сущность предложения сводится к тому, что питательную среду для выращивания продуцента Streptcmyces noursei lA 3890 подвергают стерилизации, при этом в среду дополнительно вводят фосфатосаждающие ионы металлов и карбонат кальция, концентрацию ионов сульфата увеличивают и подщелачивают среду для снижения концентрации фосфатов. --, В процессе ферментации, осуществляемой в условиях аэрации и перемешивания , регулируют величину рН, кокцентрацию глюкозы и аммонийного азота , а начиная с 1,5-2 ч от начала ферментации дробно подают в культуральную жидкость фосфаты. После завершения ферментации выделяют целевой продукт. 5 табл. i (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

А1 (1% Ol) ц 4 С 12 Р 1/06

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (89) DD 233753 (21) 7773265/28-13 (22) 09. 01. 84 (3.1) WP С 12 М/247370 (32) 20. 01. 83 (33) DD (46) 15.01.89. Бюл. У 2 (71) Народное предприятие "Йенафарм" (вв) (72) Петер Юрген Мюллер, Готтфрид

Гаубольд, Гаральд Бокер, Ганс-Гельмут

Гроссе и Михаэль Меннер (DD) (53) 615.779.93(088.8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НОУРЗЕОТРИЦИНА (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано при производстве антибиотиков. Цель изобретения — повышение концентрации целевого продукта в культуральной жидкости. Сущность предложения сводится к тому, что питательную среду для выращивания продуцента Streptomyces noursei IA 3890 подвергают стерилизации, при этом в среду дополнительно вводят фосфатосаждающие ионы металлов и карбонат кальция, концентрацию ионов сульфата увеличивают и подщелачивают среду для снижения концентрации фосфатов.

В процессе ферментации, осуществляемой в условиях аэрации и перемешивания, регулируют величину рН, концентрацию ггпокозы и аммонийного азота, а начиная с 1,5-2 ч от начала ферментации дробно подают в культуральную жидкость фосфаты. После за1 вершения ферментации выделяют целевой продукт. 5 табл.

1451165

Таким образом, общий фосфат различного содержания, переносимый через комплексные субстраты в среду глу- . бинного культивирования, присутству55 ет в начале ферментации в виде растворенного немедленно доступного фосфата.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть ис поль э ов ан о для получения стрептотрицинового антибиотика ноурэеотрицика.

В случае биосинтеэа микроорганизмом Streptomyces IMET IA 3890 Ь стрептотрицинового антибиотика ноурзеотрицина известно, что аминокисло- 10 ты и аммонийные соли отрицательно влияют на этот биосинтез (Grafe, U., Stendal, А., Bocker, Н.и Thrum, Н.

Z,Allg. Mikrobiol. 20; 185-194, 1980.

Недостатком технического примене" ния является то, что нитрат аммония является взрывчатым веществом и использование его допускается только в сочетании с мерами безопасности.

Кроме того, обнаружено в фильтрате культуры в конце лабораторной ферментации не более 3000 мкг ноурзеотрицина на 1 мл только при прибавлении относительно дорогих и вредных для окружающей среды ингибиторов ды- 25 хания и переноса аминокислот, например о-аминобензойной кислоты (OABA) (Grafе, U., Bocker, Н., Reinhardt, G. и Thrum, Н. Z. Allg. Mikrobiol 14, 659-673, 1974. 30

Известно, что избыточный фосфат отрицательно влияет на биосинтез ря" да вторичных метаболитов (Martin, J.F., Adv. Biochem. Eng. 6, 105-127, 1977. Поэтому некоторые технические процессы микробиологической фермента35 ции для получения антибиотиков проводят при концентрациях фосфата, субоптимальных для роста микробиологического продуцента. В технических ферментациях для получения вторичных метаболитов, как правило, используют такие компоненты среды растительного и животного происхождения, как крах-. мал, соевый шрот, кукурузный экст" ракт, меласса, мясной экстракт и др.

Общее содержание Ьосфата и биологическая доступность (растворимость) комплексного субстрата различное в зависимости от его происхождения и обработки.

Цель изобретения — повышение концентрации целевого продукта в культуральной жидкости.

При ферментациях для получения ноурзеотрицина после понижения начальной концентрации фосфата ниже считав-, шегося ранее оптимальным значения и последующего прибавления соответствующего или более высокого количества фосфата в процессе культивирования, добавляемого по определенному режиму времени, получаются значительно более высокие выходы ноурэеотрицина.

Кроме того найдено, что в CaGO содержащей питательной среде при замене источника азота нитрата аммония на сульфатсодержащий сульфат аммония в соотношении, стехиометрическом в отношении содержания азота, начальная концентрация фосфата снижается от 15 мг/л фосфатного фосфора (Р) до

1-3 мг/л в собственно неизменной среде после стерилизации водяным паром под давлением.

Начальную концентрацию растворимого биологически немедленно доступного фосфата в простерилизованной среде можно снизить соответствующим согласованием режима стерилизации и содержания сульфатньгх ионов и неор ганических солей или ионов металлов, дающих вместе с фосфатными или сульфатными ионами трудно растворимые осадки.

Причиной снижения такой начальной концентрации в случае присутствия достаточного количества сульфатных ионов является сдвиг кислотности слабокислой питательной среды в сторону щелочных значений рН в процессе стерилизации, вызываемый осаждением

CaS0 и связанный удалением из среды физиологически кислых сульфатных ионов. Соответственно начальная кон центрация растворимого или биологически доступного фосфата снижается также вследствие установки щелочного значения рН перед стерилизацией. Увеличение значения рН обеспечивает создание благоприятных условий для осаждения фосфата с определенными прйсутствующими в питательной среде ионами металлов. Осаждению фосфатсодержащих осадков способствует направленное прибавление таких ионов металлов. как, например, железо (Ш), 1451165 алюминии (ZIZ) магний (ТТ), кальций (IZ), цинк (II) и другие.

Особенно благоприятное влияние на осаждение фосфата оказывает применяемый в большинстве технических ферментаций метод стерилизации непосредственно воздействующим водяным паром под давлением, а также присутствие СаСО, который используется в качестве буфера для регулирования рН в процессе ферментации.

Содержание фосфата.можно снизить также уменьшением доли фосфатсодер жащих комплексных субстратов. Так, например, используемый в ферментации ноурзеотрицина экстракт соевого шрота содержит около 8 г фосфатного фосфора на 1 г шрота.

В перечисленных условиях начальная, концентрация растворенного или доступного фосфата настолько низкая, что специфические для ноурзеотрицинопродуцирующих микроорганизмов верхние предельно допустимые значения фосфата остаются ниже этого предела.

Таким образом, такие небольшие концентрации фосфата позволяют путем прибавления определенного количества, фосфата после стерилизации получить

30 среду, в значительной степени стандартизованную по фосфату. Кроме того, режим подачи фосфата позволяет управлять фосфатным обменом микроорганизмов таким образом, чтобы можно было получить продукт с высоким выходом. 35

Фосфат может подаваться в виде раствора или твердого вещества или суспензии. Фосфат может присутствовать либо в форме свободных фосфатных ионов, либо в виде химически или фи- 40 зически связанного фосфата. Подачу фосфата или фосфатсодержащих веществ осуществляют в зависимости от режима подачи после стерилизации или во время ферментации способом разового 45 и/или многоразового и/или непрерывного прибавления. Непрерывное прибавление фосфата может осуществляться с различной скоростью подачи во время. ферментации. 50

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример i. Лиофилизированные на почве консервированные споры селектанта ИС 13-14 ноурзеотрицинообра" 55 зующего штамма Streptomyces noursei

IMET IA 3890 Ъ высевают на подходящую агаровую среду, например, агар

Эмерсона. Примерно через 7-дневный о период инкубирования при 30 С вырезают участки мицелиального газона размером около 2 см, а ими засевают культуру предварительного выращивания. Среда предварительного выращивания содержит на 1 л водопроводной воды следующие вещества, г: глюкоза

40, обезмасляная соевая мука 15, КН РО 0,3, NaC1 5 и СаСОз 3. Кислотность среды устанавливают перед стерилизацией на значение рН 6,5. Эту среду заливают в закрываемые ват,ной пробкой широкогорлые бутылки емкостью 500 мл каждая в количествах по 50 мл. Стерилизацию осуществляют о

35-минутным нагревом до 121 С в автоклав е.

Засеянные культуры предварительного выращивания инкубируют в течение 48 ч при 29 С на качалке. При помощи 150 мл полученного таким образом посевного материала засевают

2500 мл основной культуры в лабораторном ферментаторе.

Для основной культуры используют среду, содержащую в 1 л следующие питательные вещества, г: картофельный крахмал 32, глюкоза 29, обеэмасленая соевая мука 11, (МНд) SO+ 11, MgS0 х7Н О 2, NaCI 1, СаСО 6 и

ZnS0q-7Н О 0,5. На 2500 мл питательной среды прибавляют 1 мл антафрона в качестве пеногасителя на силиконовой основе. Кислотность перед стерилизацией имеет значение рН 6,0.

После стерилизации заполненного

250 мл культуральной жидкости ферментатора при 121 С в автоклаве и о о последующего охлаждения до 30 С стар. товую кислотность устанавливают от рН 8,4 до рН 6,8, прибавляя асептическую добавку 10/-ной стерильной серной кислоты. Засеянные ферментационные среды инкубируют в течение 168 ч при 30 С и скорости аэрации

2500 мл воздуха в 1 мин при перемешивании с числом оборотов 800 об/мин. .Спустя 1,5 ч после засева основной культуры, при помощи перистальтического насоса-дозатора непрерывно при« бавляют раствор 4 г КН РО на 1 л дистиллированной воды в течение 5 ч со скоростью подачи 1,8 мл/ч; вслед за этим раствор прибавляют в течение

21 ч со скоростью дозирования

3,5 мл/ч. Во время ферментации в асептических условиях периодически

5 14511 берут пробы культуральной жидкости и в них методом диффузии в агар с использованием микроорганизма Bacillus subtilis АТСС 6633 в качестве

5 тест-микроорганизма определяют содержание ноурзеотрицин-основания, глюкозы, аммонийного азота и твердых веществ. Параметры РО, рН и содержание СО в отходящих из аппарата газах контролируют в ходе/процесса методом измерения с регистрацией..

Снижение значения кислотности культуральной жидкости ниже значения рН 5,8 предотвращают прибавлением стерильного 5Х-ного раствора едкого натра.

При снижении концентрации глюкозы до 5 г/л или. аммонийного азота до

0,5 г/л, что отражается на увеличении измеренных значений рН и PO, а также на снижении содержания СО в отходящих газах, прибавляют периодически 25 r глюкозы или 1О г (БН4) БО в виде концентрированных 25 стерильных растворов.

Дальнейшую ферментацию проводят без прибавления КН РО, глюкозы и (ИН4) 504 в аналогичных условиях. После прекращения ферментации в культу- ЗО ральной жидкости присутствуют четко обнаруживаемые .количества глюкозы и аммония. Концентрации ноурзеотрицин-основания, определенные в фильтратах культур обоих различных ферментационных процессов, приведены в табл. 1.

Пример 2. Лиофилизированный на глюкоэо-желатине консервированный мицелий (вес брутто консервированного содержимого — около 300 мг) названно-. го в примере 1 ноурэеотрицинообразующего штамма стрептомицетов суспендируют с 3 мл 0,9Х-ного раствора хлористого натрия, 0,5 мл этой суспензии

45 служит в качестве инокулюма для 400млсреды предварительного культивирования первой стадии.

Среда предварительной культуры имеет тот же состав и кислотность, что в примере 1. Среду заливают в эаэО крываемые ватной пробкой широкогорлые бутылки емкостью 2500 мл в количествах по 400 мл. Стерилизацию проводят

35-минутным нагревом до 121 С в авто55 клаве.

Охлажденные до комнатной темпера- туры и засеянные культуры инкубируют о в течение 48 ч.при 29 С на качалке

65 6 (180 об/мин) . Нспользуя 1200 мл полученной таким образом культуральной жидкости первой предварительной культуры, на второй стадии предварительного культивирования засевают 150 л термостерилиэованной среды (в тече-. ние 60 мин при 121 С) такого же ñîñ;. тава, как на первой стадии предварительного культивирования, содержащейся в ферментаторе из специальной высококачественной стали (общий объем

250 .л), оснащенном устройствами для подачи стерильного воздуха .и перемешивающим устройством. Культивирование проводят при 27-29 С, скорости работы перемешивающего устройства 240 об/мин и скорости подачи воздуха 1 л на 1 л культуральной жидкости в 1 мин.

Для основной культуры используют ферментаторы из специальной высококачественной стали (общий объем—

710 л), оснащенные устройствами для подачи стерильного воздуха и расположенным в центре аппарата перемешивающим устройством, которые заполнены

500 л питательной среды каждый (рецептуру см. пример 1). В качестве пеногасителя прибавляют. 0,5 г/л антафрона. Кислотность устанавливают перед стерилизацией на значение в пределах рН 6,7-7,0. Стерилизацию питательной среды (без компонента глюкозы) проводят на месте предварительным подогревом паром рубашки примерно до 70 С и последующим нагревом острым паром до 121 С в течение

15 мин, После охлаждения до темперао туры около 30 С прибавляют в асептических условиях глюкозу в виде 50%ного водного раствора, раздельно простерилизованного 30-минутным нагревом до 121 С. Перед посевом при помощи стерильной 10Х-ной серной кислоты снижают стартовую кислотность рН

8,6 до значения в пределах рН 6,9-7,1.

Ферментационные среды основной культуры, засеянные каждая 5Х иноку-. люма второй стадии предварительного культивирования, культивируют в течение 120 ч при температуре в пределах 28-30 С и со скоростью подачи воздуха 500 л в 1 мин (давление

0,14-0,16 ИПа) при перемешивании (320 об/мин).

К одной из двух культур ферментатора, начиная со 2-ro.÷ и кончая 32-м ч после засева, прибавляют при помощи перистальтического насоса-доэато14511

40 ра с постоянной скоростью водный раствор, содержащий 87 мг/л КН РО, так что в течение 30 ч на 1 л культуры прибавляют 40 мг фосфатного P.

Во время ферментации в асептичес5 ких условиях периодически берут пробы культуральной жидкости и в них методом диффузии в агар с использованием микроорганизма Bacillus sub|:ilis 1g

ATCC 6633 в качестве тест-микроорганизма определяют концентрацию ноурэеотрицин-основания и содержание глюкозы, аммонийного азота и твердых веществ. Параметры рН и содержание

СО в отходящих газах контролируют в ходе процесса измерением с регистрацией.

При падении концентрации глюкозы ниже 5 г/л или аммонийного азота ниже 0,5 г/л, что видно по нарастанию значений рН и снижению содержания CO. в отходящих газах, периодически прибавляют 5000 r глюкозы или 1800 r сульфата аммония в виде концентриро- 25 ванного стерильного водного раствора.

В другую культуру ферментатора фосфата глюкозу или сульфата аммония не добавляют. Регулирование значения рН не осуществляется; непрерывно измеряемые значения кислотности лежат в пределах рН 6,4-7,2. В момент прекращения ферментации в культуральной жидкости содержится более 5 г/л глюкозы и 0 5 г/л аммонийного азота.

Концентрация ноурэеотрицин-основания, определенные в фильтратах культур обеих различных ферментаций, приведены в табл. 2.

Пример 3. Лиофилиэированный на глюкозо-желатине консервированный мицелий (вес брутто консервированного содержимого около 300 мг) селектанта ноурзеотрицинообразующего штамма !

ИЕТ IA 3890 Ь обрабатывают в отношении предварительного культивирования, как описано в примере 2.

Для основной культуры используют лабораторный ферментатор общим объемом 7 л, оснащенный устройствами для подачи стерильного воздуха и располо-. женным в центре перемешивающим устройством, который заполняют 4,5 л питательной среды.

Культивирование проводят в модифи- 55 цированной среде (по примеру 1), содержащей 60 г/л глюкозы. В качестве пеногасителя прибавляют 0 5 г анта65 8 фрона NM-40 на 1 л культуральной жидкости.

Для моделирования технических условий стерилизацию проводят в ферментаторе из специальной высококачественной стали, заполненном 2500 л питательной среды без глюкозного компонента. Кислотность устанавливают перед ° стерилизацией на рН 7,4. Стерилизацию проводят на месте предварительным о подогревом паром рубашки до 75 С и последующим нагревом острым паром до

120 С в течение !5 мин. После охлаждения до 29 С прибавляют в асептических условиях глюкозу, раздельно простерилизованную в виде 50Х-ного расто вора 30-минутным нагревом до 120 С.

Перед засевом понижают стартовую кислотность от значения рН 8,1 серной кислотой таким образом, чтобы стартовое значение рН составляло после засева 7,4. Ферментационную культуру засевают 4ã. инокулюма второй стадии предварительного культивирования.

Для проведения опыта из ферментатора переводят 4,5 л среды в лабораторный ферментатор, который стерилизуют раздельно в незаполненном состоянии в автоклаве.

Основную культуру выращивают в течение 146 ч при 29 С и скорости аэрации 4,5 л воздуха в мин. Начальное число оборотов перемешивающего устройства 800 об/мин увеличивают для улучшения снабжения культуры кислородом; начиная с 28-го ч число оборотов мешалки составляет 1000 об/

/мин. Между 2 — м и 40-м ч после засева при помощи перистальтического насоса прибавляют 784 мг КН РО4 в виде водного раствора с разной скоростью подачи в пределах i 25- 1,75 мг фосфатного P в 1 ч и на 1 л культураль» ной жидкости. Автоматической подачей

25Х-ного водного раствора аммиака обеспечивают поддержание регулируемого значения на уровне не менее рН

6,2 и тем самым достаточное снабжение культуры аммонийным азотом. Глюкозу прибавляют периодически в виде концентрированного водного раствора тогда, когда результаты анализов, проводимых по ходу ферментации, показывают падение концентрации глюкозы ниже 10 г/л. Во время ферментации в асептических условиях периодически берут пробы культуральной жидкости и в фильтратах культуры определяют конТ а б л и ц а 1 .Содержание ноурзеотрицина в культурах штамма Streptomyces noursei

INET IA 3890 Ь-II NG 13-14 с добавками КН Р04, глюкозы и (NH4) $04 и без добавок в лабораторном ферментаторе в зависимости от времени ферментации

Время фермента ции, ч

Без добавок (контроль) С добавками (z мкг/мл Ж кг/мл

249

415

1035

100

294

48

5412

1840

100

96

120

213

195

4520

8311

8800

1О0

213

4005

9230

140.

100

9 14 центрацию ноурэеотрицин-основания методом диффузии в агар (табл, 3).

Пример 4. В процессе фермен-. тации, проводимом аналогично примеру 3, долю сульфата цинка среды основной культуры заменяют на 0,2 г/л .

Fe ($04) 9Н О. Концентрация ноурзеотрицина в фильтрате культуры составляет после 120-часовой ферментации

8200 мкг/мл (табл. 4).

Пример 5. В процессе ферментации, проводимом аналогично примеру 3, долю сульфата цинка заменяют на 0,13 г/л Al<(S04)>. 18И О. Концентрация ноурзеотрицина в фильтрате культуры составляет после 120-часо,вой ферментации 8400 мкг/мл (табл.4) .

Пример 6. В дальнейшей ферментации, проводимой аналогично примеру 5, количество содержащегося в питательной среде обезмасляного соевого шрота снижают от 11 до 4 г/л.

Далее значение рН среды устанавливают перед стерилизацией разбавленным водным раствором едкого натра на рН 8,1. После стерилизации паром под давлением значение рН устанавливают концентрированной серной кислотой таким образом, чтобы.оно сос-. тавляло рН 7,2 после засева. Фосфат прибавляют между 2-м и 72-м часами при помощи водного раствора КН Р04, который прибавляют с постоянной скоростью таким образом, чтобы было обеспечено снабжение фосфатом в количестве 1,4 мг фосфатного P в 1 ч и на 1 л культуральной жидкости.

В процессе ферментации глюкозу пе51165 10 риодически прибавляют такач образом,, чтобы концентрация глюкозы не снизилась ниже 1 г/л. Значение рН поддерживают титрованием 253-ным раст5 вором гидроокиси аммония на уровне рН 6, О.

Получаемые концентрации ноурэеотрицина приведены в табл, 5.

Таким образом, использование предлагаемого изобретения позволяет повысить концентрацию антибиотика в культуральной жидкости.

Формула изобретения

Способ получения ноурзеотрицина путем ферментации штамма Streptomyces

noursei IA 3890 в стерильной питательной среде при аэрации, перемешивании и регулировании величины рН, концентрации глюкозы и аммонийного азота с последующим выделением целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й25 с я тем, что, с целью повышения концентрации целевого продукта в культуральной жидкости, начало ферментации ведут при лимитировании фосфата, при этом снижение начальной

30 концентрации фосфата в питательной среде осуществляют в процессе стерилизации в присутствии фосфатосаждающих ионов металлов и карбоната кальция с одновременным повышением величины рН среды и концентрации иоЗБ нов сульфата, а через 1,5-2 ч от начала ферментации осуществляют дробную подачу фосфата в культуральную жидкость, 1451165

Без добавок (контроль) Время фермента ции, ч

С добавками кг/мл Ж мкг/мл Ж

104

225

216

100

1600

228

702

100

1627

485 8

299

100

4903

208

2362

100

116

6862

191

3585

100

144

7781

200

2885

100

Т а б л и ц а 3

Содержание ноурзеотрицина в культуре селектанта штамма Streptomyces noursei IMET IA 3890 b с добавками КН Р04, глюкозы и (NH<)q SO@ в ферментаторе емкостью 4,5 л в зависимости от времени ферментации

Время ферментации, ч

Концентрация ноурзеотри 1ина, мкг/мл

320

2330

6240

8010

116

11040

14070

146

Т аблица2

Содержание ноурэеотрицина в культурах штамма Streptomyces noursei IMET

IA 3890 b-II NG 13-14 с добавками КН РО, глюкозы и (NHg) SOg и без добавок в ферментаторе емкостью 500 л в зависимости от времени ферментации

Концентрация ноурзеотрицина, мкг/

/мл, по примеру

Время фермента- Концентрация нации, ч урзеотрицина, мкг/мл

Время ферментации

24 800

48

2000

5660

96

8900

11000

120

Составитель

Редактор М.Недолуженко Техред А,Кравчук Корректор И.Эрдейи

Заказ 7036/20 Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

11,3035, Москва,.Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

13 14511

Таблица4

Содержание ноурзеотрицина проведенной ферментации в соответствии с примером 4 с ионами железа (III) и

5 ферментации в соответствии с примером 5 с ионами алюминия (III) в зависимости от времени ферментации

530 800

2500 3200

5400 6300

7250 7400

8200 8400

l4

Та блица 5

Содержание ноурзеотрицина в культуральной жидкости лабораторного ферментатора с добавками КН Р04, глюкозы и гидроокиси аммония, содержащей ионы алюминия (III), в зависимости от времени ферментации