Способ получения антибиотика м 139603

 

СОКИ СОВЕТСНИХ

ОРФ Ю

РЕСПУБЛИК (19) (и) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н IYATEHTY

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ бССР

ГЮ ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 2798603/30-15 (22) 02.08.79 (31) 32172/7Û с (32) 03.08.78 (33) GB (46) 15.02.86. Бюл.У 6 (7l) Империал Кемикал Индастриз

Лимитед (СВ) (72) Дэвид Хью Дэвис, Джоффри Лайтфут Флайд Норрис (GB.1 (53) 615. 779. 931: 636.085. 57(088. 8) (59 4,С 1Z P 1/06, А 61 К 35/66, А 23 К 1/17 (С 12 P 1/06, С 12/21:

465) (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА М 139603 путем культивирования штамма Streptomyces longisporoflavus

В ClB11426 в водной питательной среде, содержащей источник ассимилируемого углерода в условиях аэробо ного встряхивания при 25-30 С, экстрагирования продукта из смеси ферментации этилацетатом, последующей очистки и выделения целевого продукта в форме свободной кислоты или ее металлической соли.

1212328

Изобретение относится к способу получения нового кормового антибиотика М 139603, повышающего количество протионовой кислоты в желудочном соке рубца за счет снижения доли метана и (или уксусной кислоты}.обладающего антимикробиой активностью относительно грамположительных микроорганизмов и возбудителя кокцидиоза. Антибиотик М 139603 может быть использован в качестве стимулятора роста жвачных животных, а также домашней птицы и свиней.

Способ получения антибиотика

М 139603 в литературе не описан.

Антибиотик М 139603 получают

;; путем культивирования штамма Strep-.

tomyces longisporoflavus NClB 11426 в,водной питательной среде, содержащей источник ассимилируемого углерода s условиях аэробного встряхио вания при 25;30 С, экстрагирования, продукта из смеси для ферментации этилацетатом, последующей очистки и выделения целевого продукта в форме свобадиой кислоты или ее металлической соли, Штамм Str. longisporoflavus

БС1В 11426 хранится в Государственной коллекции промышленных бактерий министерство сельского хозяйства, рыбной и пищевой промышленности, Торри Ризерг Стэйшн, 135 Эбби Роуд, Абердин АВ98Р, Шотландия, а также в Centraal bureauvoor Schimmelcultu.гев PO ВО 273, Oosterstraat 1, 3740

AG BAArn, Нидерланды, под номером CBS 312,79.

Штамм Str. longisporoflavus NlCB

11426 культивируется на средах, полученных в соответствии с рекомендациями для Международного проекта по Streptomyces (ИСП)" при 25 С на свету.

ИСП 1. Дрожжи Триптон (но с агаром).

5 дней - тонкий, слева влажный, бархатистый, желтовато-коричневый; обратная сторона неокрашенная.

13 дней — тонкий, бархатистый, слегка гранулированный, светло-коричневый; .обратная сторона неокрашенная.

ИСП 2. Дрожжевой экстракт (агаровый солодовый экстракт) .

5 дней - тонкий, бархатистый, светло -серый; обратная сторона. очень бледная желтовато-коричневая.

Оценка

ИСП 8

Углеродпоглощающий агар

l5 дней — углерода нет — очень редкий, погруженный

Глюкоза - тонкий (плотный), бархатис-, тый, светловатокоричневый

Арабииоза — редкий

Фруктоза— тонкий; бархатистый, светловато-коричневый

Инозитол — очень редкий

50

13 дней — значительный, рельефный, бархатистый, светло-желтый (коричневый), серый; обратная сторона коричневатая.

5 ИСП 3. Агар овсяной муки.

5 дней — редкий до тонкого, бархатистый, светло-желтый (серый); обратная сторона не видна.

13 дней - тонкий, слегка рельефный, бархатистый, светло-серый; обратная сторона не видна.

ИСП 4. Неорганические соли— исходный агар.

5 дней — тонкий, светло-.коричне15 вый, слегка гранулированный; обратная.сторона неокрашена.

13 дней — тонкий, слегка влажный коричневый; обратная сторона более или менее бесцветна.

20 ИСП 5. Глицерин — аспарагиновый агар.

5 дней — тонкий, слегка гранулированный, светло-коричневый; обратная сторона неокрашена.

13 дней — тонкий, бархатистый, светло-серый; обратная сторона не окрашена.

ИСП 7. Тирозиновый агар.

5 дней — редкий до тонкого, слег=.

30 ка гранулированный, бархатистый, светловато-коричневый (серый); обратная сторона не окрашена.

13 дней — тонкий, бархатистый, слегка рельефный, светловато-корич-. невый; обратная сторона светловато,коричневая (серая).

При старении ИСП 7 культура становится обычно более розовато-корич— .:невой, но имеет области с более

40 густой окраской, что связано с более интенсивной споруляцией.

121

Маннитол — тонкий, бархатистый

Раффиноза — очень редкий

Рамноза — редкий

Ксилоза — редкий

2328 4 при 120 С в течение 20 мин. Инокулированные колбы встряхивали при 25 С о в течение 120 ч на ротационном шэйкере, а затем содержимое колб объ-. единили и рН довели до 3, осторожно добавляя О,lн. соляную кислоту.

0,25

0 5

0,1

0 5

Общие черты.

Не образуются меланины, обратные пигменты, а также растворимые пигменты.

Споры зарождаются в открытых и плотных спиралях, часто отделенных от основных осей, более прямой несущей гифой или цепочкой спор.

Сами по себе споры трудно .увидеть в обычный микроскоп, так как они расположены очень близко друг к . другу. Споровые стенки (Е.М. на

4% ураннл ацетатном составе) гладкие..

Пример 1. Streptomyces longisporoflavus штамм NCIB 11426 вырастили в 500-мнллилитровой . колбе Эрленмейера на триптон-дрожжевом агаре, содержащем: Триптон ("Оксоид" L 42) 0,5% в/о; Дрожжевой экстракт ("Оксоид" L 21) 0,3% в/о, которую предварительно простерилизо-вали в автоклаве в течение 20 мин при нормальном давлении, рН среды примерно 7,0. Колбу встряхивали при 25 С в течение 120 ч на ротационном шэйкере.

Затем содержимое колбы использовали для инокуляции еще 10 анапогичных колб, каждая из которых содержала 200 мл следующей питательной среды, % в/о:

Сироп глюкозы 3,0

Карбонат кальция

Хлорид натрия

Сульфат магния, гептагидрат 0 05

Концентрат микроэлементов

Бактериологический пептон ("Оксонд" 1, 37) 0,1

Порошок мясного экстракта

1,"Оксоид" L 28, "Лаб Лемко")

Деионизированная вода До 100 рН довели до. 7,2 -и среду предварительно стерилизовали в автоклаве

Среду проэкстрагировали этилаЦетатом (2 600 мл), экстракты объединили и осушили над сульфатом натрия, растворитель упарили и получили маслянистый остаток (290 мг) .

Этилацетатный экстракт очистили с помощью препаративной прослойкой хроматографии на двух пластинах (Мерк "Кейселгел" 60-254, 20420 см, толщина 2 мм), используя в качестве элюента этнлацетат. Полосу при P =

= 0,39 (приблизительно) сняли с пластины и проэкстрагировали этилацетатом, растворитель упарили и получили вязкую смолу (21 мг), которая в опытах Ы чего проявила, антибактериальное действие против S.aureus.

Активную фракцию далее очислили с помощью препаративной послойной хроматографии на пластине с силикагелем ("Кейселгел" 60Е-254, 20 20 см толщина 0,25 мм), используя смесь диэтилового эфира, метанола н муравьиной кислоты в отношении 95:4:1 (по объему} соответственно. Полосу при

= 0,66 (приблизительно) сняли с пластины и проэкстрагировалн этилацетатом, в результате чего после упаривания растворителя получили вязкую смолу (9 мг) . Смолу превратили в натриевую соль встря.хивая хлороформенный раствор с раствором гидроксида натрия (0,1 М ), Хлороформенный слой отделили и высушили над сульфатом натрия, раство ритель выпарили и получили М 139603 в виде белого твердого остатка (8 мг), Т.пл.129-132 C,ÈÊ-спектр показал следующие полосы поглощения:

3300, 1725, 1645, 1565 и 915 см

Найдено, %: С 67,5; Н 8,8.

С)% Н фу Оя Ыа

Вычислено, % С 67,3; Н 8,5.

Масс-спектр: М = 624,361, расчитанный для Сз Н 0sNa = 624,364, м и е

К = 0,39, тонкослойная хроматография на Мерк 60F-254, 0,25 мм, пластины, проявитель этилацетат, наблюдается в виде коричневого пятна пос-. ле опрыскивания Зн. серной кислотой о и нагревания при 100 С.

Пример 2. Streptomyces longisporoflavus NClВ 11426 выращивали

1212328 как культуру на скошенном агаре ИСП-7

«{4$ мл), в течение 7 дней при

30 С;, Три таких посева по отдельнос ти собраны в три колбы с 100 мл стерильной воды, и полученные таким образом суспензии использованы для инокуляции трех 2-литровых колб, каждая из которых содержапа 1 л среды следующего состава, Х в/о:

Глицерин 3,0

Бактериологический пепуон ("Оксощ "

1,37) 2,0

0,024

804 7H 0

Концентрат микроэлементов

Мел Деионизированная вода До ) л, которую предварительно стерилизовали в автоклаве при нормальном давлении в течение 1/2 ч, рН приблизительно 6,7.

Подготовленные таким образом три

2-литровые колбы встряхивали в те- чение 3 дней при 30 С на ротационном шэйкере. Затеи содержимое трех колб объединили и использовали для инокулирования ферментера из нержавеющей стали, содержащего 30 л стерилизованной среды следующего состава, Х в/о:

Глицерин 3,0, Соевая мука В P 70 1,0

Мел 0,25

Церелоза 3,0

Хлористый натрий 0,5

М8$04 ° 7Н 0 0,05

Концентрат микроэлементов 0,1

Дистиллированная вода До 30 л

0,1

0,) Содержимое ферментера перемещали в течение 70,ч прй 30 С, используя для этих целей мешалку с 4 плосФ кими лопастямн, вращающуюся со скоростью 350 об/мин, и аэрацию со скоростью 15 л/мин. Перед загрузкой автоклава в смесь добавили силиконовый пеногаснтель 30 мл ("Силкон-. лапс" ), рН культуры 7,9, образующу юся ферментационную смесь (22 л) смешали с равным объемом этилацетата

Через 30 мин смесь центрифугировалй„ и этилацетатный экстракт (приблизиОбъем, мл Элюент,Ж в/о

Фракция

150

Этилацетат

) 50

150

)50

150

150

Метанол я»

150

150

Метанол

200

200

45

° I

200

Как показали результаты тонкослой» ной хроматографии на силикагеле при проявлении 20Х s/о раствором ацетона в петролейном эфире (т.хип. 60-80 С), о фракции 7-1) включительно содержат

М 139603 (R): - 0,22). Поэтому их объединили и выпарили, в результате чего получили вязкую смолу (840 мг) которую дополнительно очистили с помощью препаративной послойной хроматографии на силнкагеле ("Кейсел гель 605. 250" A.Мерк, 40 см л тельно 18 л) осушили над безводным сульфатом натрия и профильтровали.

Фильтрат упарили при пониженном

5 давлении и получили маслянистый остаток (10,7 г) .

М 139603 получили из описанного концентрата следующим образом.

Маслянистый остаток ()0,7 г) растtO ворили в минимальном объеме этнлацетата и приготовленный раствор поместили в верхнюю часть колонки с нейтб ральной двуокисью алюминия (Воелм

И, .200 г 18 см 4 см), приготовленный

15 в виде суспензии в этилацетате. Сначала колонку элюировали этилацетатом, затеи 50Х в/о смесьЬ этилацетат и метанола и окончательно метанолом.

После выхода из колонки фронта раст20 ворителя были собраны следующие фракцнне

1212328 %20 см, толщина 2 мм), используя в качестве элюента-смесь 20Х в/о ацетона в петролейиом эфире (т.кип.60.80 С). Уф-видимую полосу при

В 0,22 (приблизительно) выделили из двух пластин,и проэкстрагировали этилацетатом, экстракт выпарили досуха и получили вязкую смолу (240 мг), которая закристаллизовалась при добавлении петролейного эфира (т.кип. 60-80 С).Этот материал перекристаллизовалн из петролейного эфира (т.кип,60-80 С) и получили

М139603 в виде бесцветных кристаллов, которые отфильтровали и высушили (210 мг), т.пл. 176-178 С °

Уф-спектр в эталоне имел полосы поглощения при 234 нм (E = 12900) и 272 нм (E = 10800). ИК-и ЯМРспектры аналогичны полученным для продукта примера 1.

П р.и м е р 3. М139ЬОЗ (40 мг) растворили в смеси ацетона (10 мл) и воды () мл ), добавили 1 мл 2н. соляной кислоты и смесь интенсивно перемешивали в течение 5 мин. Добавили дистиллированную воду (20 мл), смесь проэкстрагировали дихлорметаном (2 ° 10 мл). Органический слой отделили и промыли 2н. соляной кислотой, а затем дистиллированной водой. После этого дихлорметановый слой уцарили и получили вязкую смолу (33 мг) свободной кислоты, соответствующей М 139603.

Найдено, Х: С = 69,5; Н =

СМН5 0g

Вычислено, Х: С = 69,8; Н = 9,0.

ИК-спектр, снятый на таблетке из

К8, имеет характеристические полосы поглощения прн 3500,1765,1650, 1575 см

Пример 4. Свободную кисло.ту, соответствующую.М 139603 (30 мг)растворили в смеси тетрагидрофурана (7 мл) и воды (1 мл) . К водной тетрагидрофурановой смеси добавили гидроксид щелочного металла, ХОГ (2Н, 2 мл) и смесь затем интенсивно перемешивали в течение 10 мин.

Добавили воду (10 мл), и раствор проэкстрагировали серным эфиром (2 ° 15 мл). Э .>ирные экстракты объединили и выпарили, в результате чего получили соли щелочных металлов, соответствующие натриевой соли, М 139603.

Когда Х вЂ” калий, то образу. ется калиевая соль, т.пл. 146-150 С ь °

2p . сокращения доли ацетата (Ac/Pr )a летуСобрали желудочный сок рубца от двух бычков-катратов, которых кормили одинаковым кормом, состоявшим из сена и концентратов. Время взятия проб по воэможности максимально стандартизировали, желудочный сок двух животных собирали в соотношении 50/50. Болыпие твердые включения отфильтровывали через четырехслойную муслиновую ткань. Затем фильтрат разбавляли в соотношении один объем фильтрата к трем объеЗ5 мам искусственного желудочного сока рубца (приготовленного по методике

Г.Л.Бейлза), но без использования . уксусной кислоты. РН смеси довели до Ь,9-7,0 с помощью насыщенного

5

15 молекулярная формула СЗФН> 08K KBK показано масс-спектрометрией, котоФ рая дает молекулярный ион М массои

640, 335, рассчитано для С Н О К =

= 640 338.

Найдено, «/: С = 65,7Х; Н = 8,5Х.

01sН,ь0в К,-Вычислено, С = 65,6, Н = 8,3

Когда Х вЂ” рубидий, то образуется рубидиевая соль, Т.пл. 95-120 С, молекулярной формулы С95Н»О Rb, установленной масс-спектрометрией, которая дает молекулярный ион М массой 686,279, Рассчитанный для

С.. H s Î 8 686,286.

Пример 5. Способность

М 139603 ингибировать образование метана в рубце жвачных животных и увеt личивать количество протионата за счет чих жирных кислотах (ЛЖК ), проиллюстрирована следующим образом. водного раствора карбоната натрия.

Аликвотные количества (50 мл) этой смеси распределили в 100 мл конические колбы, содержащие высушенное измельченное сено (0,5 г), и каждую колбу использовали для оценки испытуемого соединения при данной концентрации.

Испытуемое соединение вводили в коническую колбу в виде спиртового раствора (этанольного), колбу продувалн углекислым газом, закрывали пробкой (резиновой) и термостатировали при 39 С.s течение 15-16 ч.

Через 1 ч узкую полую иглу вставляли через резиновую пробку для снятия давления газа и иглу вынимали за 30 мин до конца термостатирования. Затем процесс ферментации оста1212328

Таблица 2

Испытуемье группы етат Пропионат

Таблица 1

Ацетат/ пропионат, Ж относи тельно контрольного

Метан, Х относительно контрольного

Концентрация, иг на мл

Соединение

°, Положительные контрольныемонензин

0,5 иг/кг

32,3

57,1

58

М 139603 1,0

0,3

87

0,1

7.9

67.

Монензин 1,0

90

0,3

95

100

0,1 навливали, поиещая колбу на лед, и после 15-минутного охлаждения анализировали газ, находящийся над жидкостью, на содержание в нем метана с помощью газовой хроиатографии. Затем содержимое колб фипьтрова ли через предварительно высушенный стеклянный фильтр. Три образца фильтрата анализировалн методом газовой хроматографии на содержание ЛЖК и, сравнивая это количество t предварительно определенным количеством ЛЖК до термостатирования, определяли точное количество ЛЖК (ацетата и пропионата1, образующихся в процессе термостатирования.

Были получены следующне результаты, выраженные.в процентах от контрольных величин, полученных в отсутствие исследуеиых соединений (табл.l). Момензин, известный проиотор роста, влияющий на функцию руб» ца, включен в виде контрольного соединения.

Пример 6. Способность

М 139603 увеличивать долю пропионата за счет сокращения доли ацетата в желудочном соке рубца овец проиллю- стрировали следующим образом.

Двадцать три овцы содержали отдельно на одинаковом рационе,состоящем из 1 кг брикетов сена на одного животного в день. Брикеты делили пополам и давали дважды в день. Овец произвольно разде, пили на 13 отрицательных контрольных н

5 положительных контрольных, которьва давали моненэин, известный регулятор рубца, а 5 животньж давали определенную дозу М 139603. Подопытиьвю животным давали момензин или

M 139603 орально в количестве

0,5 мг/кг в течение четырех дней подряд, и пробы желудочного сока рубца собирали с помощью желудочного зонда через 6 ч после введения исследуемых соединениЯ на четвертый день. Затем образцы желудочного сока рубца анализировали на содержание в нем ацетата и пропионата, как.описано в примере 2. Были. получены следующие результаты (см. табл.2). олярный 7. от,общего оличества ЛЖК

Отрицательная контрольная 69,9 19,8

М 1396030,5 мг/кг 54,2 39,9

Снижение доли ацетата в случае использования М 139603 значительно при P + 0,02 по сравнению с положительной контрольной группой, которой вводили монензин, Увеличение доли пропионата в случае использования М 139603 значительно при р < 0,001 по сравнению с положительной контрольной группой, которой вводили монензин.

Пример 7. Антибиотик

M 139603 обладает также,антнкокцидиоэньвк действиеи, Это показано пробой тканевой культуры в клетках почек цыплят, зараженных спорозоитами Eimerià tenella. В этом опыте

М 139603 предотвращает рост спорозоитов при концентрации С0,001 части на миллион и обладает токсичным действием на клетки хозяина только при концентрации ф0,33 части на миллион.

Составитель

Техред М. Герг ель

Редактор M. Недолуженко

Корректор М.Самборская

Заказ 653/62.

Тираж 490 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная,4

11 1212328 12

Соединение М 139603 также облада- Corynebacterium acne при концентрает грамположителЬным антибактериаль- ции 6 10 мг на мл и поэтому может ным действием и предотвращает рост быть использовано как промотор роста

Staphyllococcus aureus, Streptococcus нежвачных животных, например домашfaecalis, Clostridium velchii, 5 ней птицы и свиней.