Способ получения антибиотика

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА формулы он И СН, заключающийсй в том, что штамм Streptorayces halstedii АТСС 31812 культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода и азота и минеральные соли, в глубинных аэробных условиях с последующим вьщелением целевого продукта из культуральной жидкости и при необходимости переводом его в катионную соль. (Л с

СОЮЗ СОЭЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (! 9) ((1) 4(5l) С 12 Р 1/06

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

СО,Н

Сн

Сн

ОН сн,он

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР пО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTHA (21) 3464034/28-13 (22) 14.07.82 (31) 285,264 (32? 20.07.81 (33) СНА (46) 15.04.85. Бюл. Р 14 (72) Вальтер Даниель Келмер, Вальтер Патрик Куллен (СНА), Ритиро Сибакава и Дзюнсуке Тоне (Япония) (71) Пфайзер, Инк. (США)

{53) 615.779.931(088.8) (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА формулы з а к л ю ч а ю шийся в том, что штамм

Streptomyces halstedii АТСС 31812 культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода и азота и минеральные соли, в глубинных аэробных условиях с последующим выделением целевого продукта из культуральной жидкости и при необходимости переводом его в катионную соль.

1151219

ОН Or>

,ОН

ОН

Изобретение относится к микробиологической промьш ленности и касается получения нового кислотного полиэфирного антибиотика, Аналогов в патентной и научнотехнической литературе не обнаружено. штамм Streptomyces halstedii ATCC

31812 культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода и азота и минеральные соли, в глубинных аэробных условиях с последующим вьщелением целевого продукта из культу- 20 ральной жипкости и при необходимости переводом его в катионную соль.

Используемый для осуществления способа микроорганизм Streptomyces

halstedii выделен из образца почвы в

Японии. Депонирован в American Type

Culture collection под номером 31812.

Штамм Streptomyces halstedii

АТСС 31812 характеризуется следующими признаками. 30

Культурально-морфологические признаки.

Агар дрожжевого экстракта — солодового экстракта — хороший рост, цвет от кремового до светло-желтова- З5 того, умеренно повышенный, гладкий, загрубленный до морщин, без воздушного мицелия; обратная сторона такая же, как поверхность; растворимый пигмент отсутствует. 40

Агар овсяной муки — умеренный рост, серый до коричнево-серого, от слабого до слегка повышенного, гладкий с небольшими белыми пятнышками; слабый воздушный мицелий, белый до светло-сероватого; обратная сторона такая же, как поверхность; растморимый пигмент светло-желтоватый.

Неорганические соли — крахмаловый агар - умеренный рост, желтовато-0 коричневый до коричневого, жидкий, гладкий, без воздушного мицелия; обратная сторона такая же, как поверхность; растворимый пигмент отсут.ствует. 55

Глицерин — аспарагиновый агар— рост от умеренного до слабого, тускло-белый, жидкий, гладкий с небольЦель изобретения — создание способа получения антибиотика.

Цель достигается тем, что согласно способу получения антибиотика формулы

I шими белыми пятнами; слабый воздушный мицелий; белый; обратная сторона такая же, как поверхность; без растворимого пигмента.

Тирозиновый агар Гордона и Смита— рост от слабого до умеренного, бесцветный до кремового, жидкий, гладкий, без воздушного мицелия; обратная сторона такая же, как поверхность; без растворимого пигмента.

Чапек-сахарозный агар — слабый рост, бесцветный до тускло-белого, жидкий, гладкий, с небольшими белыми пятнами воздушного мицелия; обратная сторона такая же, как поверхность; без растворимого пигмента.

Глюкозо-аспарагиновый агар— умеренный рост, желтовато-серый до лавандово-серого, жидкий, гладкий, но слегка сморщенный вблизи края; воздушный мицелий светло-серый; обратная сторона такая же, как поверхность; растворимый пигмент светло-желтый.

Агар с кальциевой солью яблочной кислоты — слабый рост, бесцветный с тускло-белым краем, затопленный, гладкий с небольшими пятнами сероватого воздушного мицелия; обратная сторона такая же, как поверхность; без растворимого пигмента.

Казеиновый агар — умеренный рост, светло-коричневый, жидкий, гладкий до слегка загрубленного, без воздушного мицелия; обратная сторона такая же, как поверхность; без растворимого пигмента.

Агар Баннета - хороший рост, коричневый, повышенный, морщинистый, без воздушного мицелия; обратная сторона такая же, как поверхность; растворимый пигмент светло-желтоватый.

1151219

Агар водной вытяжки — плохой рост, бесцветный до мутно-белого, жидкий, гладкий, с небольшими белыми пятнами воздушного мицелия, обратная сторона такая же, как поверхность; растворимый пигмент отсутствует.

Физико-биологические свойства.

Меланин не образуется. Сероводород не образует. Желатин разжижает. 4S

Крахмал гидролизует. Нитрат восстанавливает до нитрита. Ограниченный рост на целлюлозе Иенсена. Отсутствует рост на целлюлозе Левина и Шоенлайна. Нет разложения на обеих целлюлозных средах.

Молоко не коагулирует, не пептонизирует. . Не усваивает каэеин, кальциевую соль яблочной кислоты и тирозин.

На среде Нономуры использует глюкозу, арабинозу, ксилозу, плохо усваивает рафинозу; не успевает сахарозу, Агар Эмерсона — рост от умеренного до хорошего, светло-желтовато-корич— невый до зеленовато-серого, жидкий до повышенного, гладкий до слегка загрубленного или возникающий как 5 мембранные чаши, которые нерегулярно

1 сморщены, без воздушного мицелия, обратная сторона такая же, как поверхность; без растворимого пигмента.

Питательный агар — рост от слабо- 10

ro до умеренного, светло-желтоватый, жидкий, гладкий, без воздушного мицелия; обратная сторона такая же, как поверхность; нет растворимого пигмента. 15

Желатиновый агар — рост умеренный, светло-желтоватьп, жидкий, гладкий, без воздушного мицелия; обратная сторона такая же, как поверхность; без растворимого пигмента. 20

Крахмаловый агар — хороший рост, кремовый, светло-желтоватый до светло-желтовато-коричневого, жидкий до несколько повышенного, гладкий, но сморщенный по направлению к краю, без воздушного мицелия; обратная сторона такая же, как поверхность; без растворимого пигмента.

Картофеле-морковный агар — умеренный рост, кремовый (2 са) с сероватым до темно-серого краем, жидкий, гладкий, воздушный мицелий от серого до темно-серого; обратная сторона такая же, как поверхность; растворимый пигмент отсутствует. иноз тол, маннитол, фруктозу и рамнозу.

На среде ISP В 9 импользует глюкозу, арабинозу, ксилозу, и сахарозу, не усваивает фруктозу, инозитол, маннитол, раффинозу и рамнозу.

При культивировании на картофелеморковном агаре в течение 15 сут масса спор серого цвета, цепочки спор прямые, искривленные, нерегулярно изогнутые или волнистые, изредка крючковатые, от 10 до 30 спор в каждой цепочке, редко менее 10; скосы овальные, от эллиптических до стержнеобразных, 1-1,8х0,8-0,9 мкм, гладкие.

Хороший рост при 21-28 С, может расти и при 37-45 Ñ.

Пример 1. Готовят стерильную среду следующего состава, г/л воды: церелоза 10; крахмал 20; дрожжевой экстракт 5; Ф Е УТТ {казеин ферментативного переваривания) 5; дикалийгидрофосфат 0,5; мясная мука 5; хлорид кобальта 0,002; карбонат кальция 4; рН среды 7,2-7,1.

Культуру со скошенного агара переносят в ряд колб объемом 300 мл, каждая из которых содержит по

40 мл стерильной среды указанного состава, встряхивают на роторной качалке при 28-36 С в течение 3-4 сут. о

Аликвоту растущей культуры, достаточную для обеспечения 2 об.Е инокулята, переносят в 4-литровые ферментеры, каждый из которых содержит

2 л стерильной среды следующего состава, г/л воды: перелоза 10;

9 Z амин А (каэеин ферментативно переваренный 5; крахмал 20; дрожжевой экстракт 5; карбонат кальция

1; хлорид кобальта 0,002.

Ферментацию ведут нри 30 С и перемешивании со скоростью 1700 об/мин и степени аэрирования 1V об. воздуха/U об..среды/мин. в течение 3-5 сут.

Культуральную жидкость фильтруют при нейтральном рН, фильтрат экстрагируют метилизобутилкетоном или н-бутанолом. Органическую фазу отделяют -от водной фазы и фильтруют для удаления суспендированного материала.

Твердое вещество на фильтрате суспендируют в метаноле, отфильтровывают, метанол выпаривают и остаток экстрагируют тем же растворителем. Экстракты объединяют и выпаривают в вакууме, получают вязкое масло. Его сус1151219 пендируют в гептане, перемешивают с силикагелем и фльтруют. Остаток на фильтре повторно промывают гептаном, продукт ступенчато элюируют чистым хлороформом, смесью хлороформа и 5 этилацетата и чистым этилацетатом.

После проведения тонкослойной хроматографии и биоанализа фракций активные фракции объединяют, выпаривают в вакууме и остаток повторно хроматографируют для получения антибиотика 53607 в виде твердого вещества.

Инфракрасный спектр (таблетка с КВг), мкм: 2,95; 3,42; 6,00; 6,37;

6,85; 7,14; 7,30;7,65; 7,90; 8,1,9,05;

11,40; 11,75; 13.,25. Антибиотик растворим в хлороформе, этилацетате, метиловом спирте и метилизобутилкетоне; не растворим в воде.

Пример 2. Готовят инокулят по примеру 1, но используют 700 мл среды в каждой колбе, инокулят ферментируют во встряхиваемой колбе при 5

28 С в течение 3-4 сут, смешивают в двух бутылях с боковыми отводами.

Ферментер емкостью 6435 л, содержа- . щий 4542 л стерильной среды, указанной ниже, инокулируют 6 л (0,1Х) указанного ииокулянта. Ферментационная среда, г/л: церелоза 1,0; казеин 5,0; крахмал 5,0; карбонат кальция 3,0; хлорид кобальта 0,002; жидкость после замачивания кукурузы 5,0 мл; вода до р5

1 л рн 6,9-7,0, о

Ферментацию ведут при 28 С при аэрировании и перемешивании со скоростью l700 об/мин. Цереэ 120 ч ферментер выгружают. Весь бульон экстрагируют 946 л метилизобутилкетона, слои фаз разделяют в экстракторе Подбельняка .и органическую фазу концентрируют в вакууме, получая 30,3 л масла.

Масло дополнительно концентрируют 45 в вакууме на роторном испарителе. .Остаточный сироп суспендируют в гептане, перемешивают с силикагелем и фильтруют, промывая несколько раз гептаном. Промытый остаток на фильт- So ре обрабатывают по примеру I, получая

300 r масла, которое растворяют в небольшом количестве хлороформа, раствор выливают на фильтр (Лэпп), содержащий 3,5 кг силикагеля, и си- 55 ликагелевый слой последовательно промывают порциями по 19 л хлороформа, этилацетата и ацетона. Фракции исследуют методом тонкослойной хроматографии. Найдено, что продукт почти полностью содержится в этилацетатной фракции. Прочие фракции выбрасывают, этилацетатную фракцию выпаривают досуха в вакууме, получая 150 r концентрата. Концентрат дополнительно очищают хроматографически на колонке

8,0х1000 см, заполненной тем же силикагелем, суспендируя концентрат в этилацетате. Колонку элюируют этилацетатом, отбирая литровые фракции, со скоростью 60 мл/мин. Фракции, содержащие продукт, собирают и выпаривают в вакууме, получая 85 г продукта.

Этот продукт пропускают через колонку, содержащую 1 кг смолы Сефадекс

Эль-Эйч-20, элюируют метанолом со скоростью 25 мл/мин. Отбирают фракции объемом 300 мл. Объединяют фракции, содержащие продукт, и выпаривают растворитель, получая 30 г твердого вещества, которое растворяют в 500 мл хлороформа, раствор„промывают равным объемом 57.-ного натрийдигидрофосфатного буфера, который доводят до рН

4,5 добавлением 857-ной фосфорной кислоты. Отделяют органический слой, промывают его 500 мл 5Х-ного динатрийгидрофосфатного буфера, который доведен до рН 9,0 добавлением 1 н. раствора гидроокиси натрия. Затем экстракт высушивают над безводным сульфатом натрия и выпаривают досуха в вакууме. Твердый остаток растворяют в ацетоне и дают выкристаллизоваться в холодильнике. Кристаллы собирают путем фильтрации и высушивают при глубоком вакууме при комнатной температуре, получая 14 г натриевой соли соединения антибиотика 53607 с т.пл. 199-204 С.

Оптическое вращение: (к)в+44 (C=1, в хлороформе), (N)>+37 (С=1, в метаноле) .

УФ-спектр: h>

Инфракрасный спектр (таблетка с KBr) мкм: 2,95; 3,42; 6,00; ,37> 6,85.; 7, 14; 7,30; 7,65; 7,90;

10 18; 10 53; 11,15; 11,40; 11,75;

13,25.

Элементный анализ: С 57,54; Н 7,74, N 0,0.

Применяя буферные растворы

KH P0) (pH 4,5) и К НРО4, доведенный до рН 9,0 l н. раствором гидроокиси

11512 1 9

Составитель Г. Смирнова

Техред О. Ващишина Корректор А. Обручар

Редактор О. Колесникова

Заказ 2191/47 Тираж 525 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 калия, по указанной методике аналогично получают калиевую соль соединения антибиотика 53607 (аналогично получают аммониевую соль, используя в указанной методике дигидрофосфат аммония и диаммоний гидрофосфат).

Часть полученной натриевой соли соединения антибиотика 53607 растворяют в этилацетате, добавляют воду и доводят водную фазу до рН 4,5, под- 10 кисляя ее 857-ной фосфорной кислотой.

Отделяют органический слой, высушивают сульфатом натрия и выпаривают в вакууме, получая соединение 53607 в виде свободной кислоты с т.пл. 15

84-95 С.

Данные элементного анализа получают для образца, высушенного в течение ночи в глубоком вакууме при комнатной температуре: С 64,69; Н 8,91; 20

N 0,0.

Найдено, что эта кислота не растворяется в воде; растворима в хлороформе, этилацетате, метаноле и метилизобутилкетоне 25 (Ы) +74,5О (С=1, в хлороформе), (о() +49,7 (С=1, в метаноле) .

УФ-спектр:% „„,= 233 нм (в метаИК-спектр (таблетка с KBr), мкм: щ

2,95; 3,45; 6,00; 6,85; 7,28; 8,13;

11,48.

Бариевую соль получают встряхиванием 2,0 r свободной кислоты, растворенной в 80 мл этилацетата, с равным объемом .воды, содержащей 2,4 г октагидрата гидроокиси бария. Раздеt ляют слои, промывают органическую фазу свежим раствором октагидрата гидроокиси бария, высушивают сульфатом натрия и выпаривают в вакууме, получая соль соединения антибиотика 53607.

Кальциевую соль, готовят по ука занной методике, но используя гидроокиси кальция вместо октагидрата гидроокиси бария.

Пример 4. По методике примера 1 используют 4%-ный раствор инокулята в 4-литровых ферменторах, каж дый из которых содержит 2 л следующей стерильной среды, г/л:церелоза 10; кукурузный крахмал 10," соевая пудра

10; карбонат кальция 1; ферментируемое твердое вещество кукурузы 5; хлористый натрий 5; рН 7,0.

Ферментацию проводят в течение

2 сут при 36 С и перемешивании со скоростью 1700 об/мин при продувке воздухом со скоростью 2 об/1 об бульона/

/мин. Весь бульон экстрагируют хлорс †. формом и обрабатывают по примеру f получая соединение антибиотика 53607 в виде смеси его натриевой, калиевой и кальциевой солей.

Когда указанную методику повторяют, но вместо церелозы используют в ферментационной среде глицерин, а также рыбную муку или муку из семян хлопка вместо ферментизируемого твердого вещества кукурузы и проводят ферментацию при рН 8,0, 28 С в течение 6 сут, то получают практически те же результаты.