Способ получения гликопротеина,обладающего противоопухолевой и лектиноподобной активностью
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСГ1УЬЛИН с
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕ ГЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3396893/28-13 (22) 09. 02. 82 (31) 18655/81 (32) 10.02.81 (33) JP (46) 15.02.87. Бкл. № 6 (71) Куреха Кагаку Когио Кабусики
Кайся (JP) (72) Тикао Есикуми, Такаеси Фудзи, Такоо Фурусо, Кенити Мацунага, Минору Охара и Акира Кобаяси (JP) (53) 615.45.615.7(088.8) (56) Патент США № 4051314, кл. 536-1, 1977.
Патент CliIA ¹ 4202969, кл. 536-1, 1980. (54)(57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛИКОПРОТЕИНА, ОБЛАДАН)ЩЕГО ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ И ЛЕКТИНОПОДОБНОЙ АКТИВНОСТЫО, заключающийся в том, что мицелий гриба рода Coriolus экстрагируют водой (ю С 12 P 1/06, С 12 N 1/00 или водным 0,01-2,0 н. раствором щелочи при .температуре 80-100 С в течение 1-8 ч, из полученного экстракта удаляют низкомолекулярные вещества путем диализа и/или ультрафильтрации, полученный концентрат подвергают фракционному осаждению в изоэлектрической точке с рН 2,5 — 5 при ионной силе раствора от 0,1 до 3,1 при температуре 5-25 С в течение 1-8 ч, при поддержании рН на заданном уровне в процессе фракционирования выделяют фракции, содержащие целевой продукт, нейтрализуют, обессоливают и высушивают.
2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что экстракции подвергают мицелий гриба Coriolus versicolor (Fr.) Quel, Coriolus hirsutus (Fr.) Quel, Coriolus pargemeaus (Fr.) Pat., Coriolus consors (Berk)
Imaz, 1291027
5Î
Изобретение относится к медицине и касается получения биологически активного соединения.
Цель изобретения — создание способа получения нового гликопротеина, обладающего противоопухолевой и лектиноподобной активностью.
Способ иллюстрируется следующими примерами, Пример 1. Штамм CN-101
Corioius versicolor (Fr.) fuel (FERNР2412; АТСС 20547) культивируют в питательной среде, содержащей, вес.X: глюкоза 5; пентон 0,2„ дрожжевой экстракт 0,3 КН PO„ О,i NgSO. 7Н О
0,1, в течение 10 дней.
Развившийся на поверхности культуральной среды мицелий гомогенизируют с водным физиологическим раствором и получают посевную культуру.
Ее высевают в каждый из 100 сосудов для культивирования емкостью
1 л, содержащих по 200 мл среды вышеописанного состава и культивируют в течение 25 дней при 25-27 С. Получают 2,0-4,5 г/один сосуд проросшего мицелия
100 r полученного мицелия зкстрагируют 3 л водного О, 1 н.раствора
Na0H при 9? C в течение,1 ч. Экстракт отделяют, нейтрализуют кислотой и концентрируют.
Концентрат обессоливают и затем последовательно подвергают диализу и ультрафильтрации для удаления низкомолекулярных соединений, имеющих молекулярный вес менее 5000, Концентрат (или порошкообразное соединение, полученное высушиванием обработанного концентрата) смешивают с фосфатным буфером для поддержания рН смеси 3,5 и после нейтрализации супернатанта, полученного центрифугированием смеси, его подвергают ультрафильтрации для удаления солей, причем ультрафильтрацию проводят под давлением 1,5 кг/см при 10 С с одновременным охлаждением и перемешиванием на аппаратуре для ультрафильтрации (настольный Highflov-,2000, Amicon Comnany с диафрагмой ДМ-5), После концентрирования обессоленного супернатанта в концентрат добавляют фосфатный буфер для поддержания рН смеси 3, затем смесь центрифугируют и собирают осадок.
Фракции, осаждающиеся при стабилизированном рН 3,5, ионной силе 0,30п
2 и температуре 5 в чечение 2 ч, от брасывают, а собирают только фрак.:,ии, осаждаемые из оставшегося раствора при рН 3,0 (изоэлектрической точке в интервале р11 3,0-3,5) .
Осадок растворяют в воде, доводят рН до 7,0 и очищают обессоливанием, затем вь сушивают до порошкообразного состояния.
Гликопротеин имеет следующие характеристики.
Молекулярный вес 5000-300000. Весовое отношение белковой части к его сахаридной части от 50/50 до 80/20.
И-концевая кислота представляет собой в основном тирозин, лейцин или аланин.
С-концевая аминокислотная последовательность представляет собой лейцинфенилаланин-валин, Элементный состав, 7.: углерод
35,2-49,3; водород 4,8-8,0; азот
4,3-12,3; сера от следов до 2,5; фосфор от следова до 1,2; кислород остальное, Изоэлектрическая точка лежит в ин тервале рН 2,5-5,0,, В качестве компонента в гликопротеин входит нуклеиновая кислота.
По данным инфракрасной спектроскопии поглощения гликопротеин имеет максимум поглощения в интервалах
3600-3200 и 1200-1000 см, а также при 1бОО и 1530 см .
Пример 2-18. Вместо штамма
CN-101 используют каждый из штаммов грибов, представленных в табл.
Мицелий экстрагируют водным растворчтелем, таким как горячая вода или водный 0,01-2,0 н, раствор щелочи при
80-100 С в ". å÷å:íèå 1-8 ч. После удаления экстрагируемого остатка водный экстракт нейтрализуют кислотой и концентрируют, .После обессоливания концентрат при необходимости подвергают диализу и/или ультрафильтроBàíèþ для удаления низкомолекулярного соединения (м.в. менее 5000). Полученный очищенный продукт при необходимости концентрируют и сушат до порошкообразного состояния. Затем прод,"кт подвергают, фракционному осаждению в изоэлектрической точке с рН 2, .-5,0, ионной силе О, 1-3, 1р и при те .н ра уре среды 5-25 С, в течечие более, чем
05ч.
Характеристики полученных препаратов приведены в табл. 1.
1291027
Физические и физиологические свОЙ ства предлагаемого сединения по примерам 1-18 приведены в табл. 2.
Каждое из соединений по примерам
1-18 проявляет следующие характерные цветные реакции сахарида и белка; с -нафтол — сернокислотная .реакция— цвет темно-красный; индол — сернокислотная реакция — цвет коричневый; антрон — сернокислотная реакция — цвет 10 зеленовато-голубой; фенол — сернокисТа блица1
Штамм Strain Номер депонирования Deposition
Number of the Strain
Вид культуры Species
СМ-101
CM-102
CN-103
СМ-104
versicolor
Coriolus
Quel
CM-105 (Fr.) versicolor
Coriolus
Que1
CM-106
СМ-107
СМ-108
CM-109
CN-110
CN-111
СМ-112
CN-! 13
Coriolus ver icolor (Fr.)
Quel
Coriolus versicolor (Fr.)
0uel
Coriolus versicolor (Fr.)
Quel
Coriolus versicolor (Fr.)
Que1
Coriolus versicolor (Рг.)
Quel
Coriolus versicolor (Fr.)
Quel
Coriolus versicolor (Fr.)
Quel
Coriolus versicolor (Fr.)
Quel
Coriolus versicolor (Fr.)
Quel
Сог1о1иь versicolor (Fr.)
Que1
Coriolus versicolor (Fr.)
Quel лотная реакция — цвет коричневый.; триптофан — сернокислотная реакция цвет красновато-коричневьш; тиоглико-. левая кислота — сернокислотная реакция — зеленовато-коричневый; орсин ! солянокислотная реакция — зеленоватокоричневый; реакция Лоури-Фолина— цвет синий; нингидриновая реакция продукта гидролиза гликопротеина хлористоводородной кислоты — красноватосиний.
FERM-P 2412 (АТСС 20547) РЕКИ-P 2413 (АТСС 20548) РЕКИ-P 24 14 (ATCC 20545) FERN-P 24 15 (АТСС 20549) FERN-P 24 16 (АТСС 20550) РЕКМ-P 2417 (АТСС 20551) РЕКИ-Р 2418 (АТСС 20552) FERN-P 2419 (АТСС 20553) РЕКМ-P 2420 (АТСС 20554) FERN-P 242 1 (ATCC 20555) FERM-P 2422 (АТСС 20556) FFRM-Р 2423 (АТСС 20557) РЕКИ-P 2424 (АТСС 20558) 1291027
CN--! i 4
СМ-115
Coriolus hirsutus (Fr.)
Que1
СМ-151
Coriolus pargemenus (Fr.)
Pat.
CN-16 1
Coriolus versition (Fr.)
Quel
CN-- i 01
Coriolus consors (Berk.)
Imaz
СЧ--166
Coriolus
Quel
Coriolus
Quel
versicolor (Fr.) versicolor (Fr.) Продолжение таба.3
РЕИ1-P 2425 {АТСС 20559) ГЕВМ-P 24 26 (ATCC 20560) FERN-Р 2711 (АТСС 20561) FERN-P 2712 (АТСС 20562) FERN-P 3686 (ATCC 20564) FERN-P 988 (ATCC ?0565) (1
CO (1
CO
CO
0 о .Т
СО и
Г 4
Т л
СЪ (4 с 4 л
СЧ
О с
С4
in и о (и
Г Ъ
« л
Т
CO ÷ (4 (4
О
СЧ т (и
С4
О о.Т гч
01 о
О (4
«т
Т
С4
Т
СЧ (тъ о и
С4 о
О
l м
СЧ л (О сч
-Т о! о о
0 и т
Ч и т
Г4 о
С 4
t (т(СЪ
«т о (С
СО
l
СЪ о и г
Т (и
СО
Г Ъ
Оъ О
v ъо м
ГЧ
-т
«т
Г \
СО
Ctl м
С Ъ
1 т
С 4 о и
Cl,1 33 (ч о и
«4 (О
t и
СО т
Т и г п о
Т
Т
CO м
Г (4
О о и
СЪ т л
С 1 о
С 4
/4
Т
4!
С Ъ
Г 4
Г Ъ
О о
00 с
Ю О
° Т
О о
f ь
« ф (4
lO о ( о
X а
lC
С х
0l о
X о о х
t х ф
O
С
X
I0 аъ о к ф х (а K ф
С
s I
С
I ф
I
1
1 ! !
I !
1
I
I
1
i 1
rt 1!!
1 !
1 !
I Г !
1 1 и
«Т I!
О
С
Э
1 ф
IO к о
И и х
I и и (4 Т!
in î сч и
1 Ъ О
ГЧ /\
1 пи (4 т
1 оо и
l ии
P (4 Т
С
1 по (ъ и
I ио
-т и
I и о
/4 И! и и
:ч -т
1 и-о ч -т
1 и и (4 ГЪ
I ио
Гч(\
/1 т
1 о in т т
1 ио г ъ т
o in (l С"1
1 о
7 х й
t и
-о
1 и
«о о п! и
° о ом! (П о о и
\/1
«о оf
I и
° о о п
t и о о
1 и
-о ом
1/\
-o
O -1!
i/1
*Ю
o n
I и
«PO ом
I и
-о ом
1 и
«о
1 и
° о о ."ъ
I и
«о ом
1 и
««о ом
1 (и
«о
1 и
«о
ОС!
lO а«. фо ! х х
° О
in (О и 0
I с т м л и (Ч O
4! t ("4 ф
° О CO о о
Г f с \
C 4
О (1 и о
0 и
О г « (\ ОЪ
И О ао О г О.Ч
Сч о (О (т о
-т и
СЪ Г и «т с(О (О С4 г (ч (1 О сЪ
О 01
-т и (тъ
СЧ Л п (4 CQ
С 0
О ао
«f и
Л СЪ
ОЪ т с с
° О .т,/
0 л го
С 1 с о т О
0«О г и
С О
Р г м и (п
:т
CO .т (п (4 ао м г т и
Гч 00 (О Г
Cf
3 f0
И х х ф
Ю Ф
С и и
m ф к м а а
0l Э
О! С( о о о
z о . ° с Т4 и о о х ф
3.
Х 44 а! х
43 IC х а ф О
v ц
О CO о
01 ."1 о
X а и
0(О
С 1
О
0 4
0О
CO и .Т
° /4 о ч
С 1
° ф
:Ч
О
Т
«
С Ъ С 1
l»
01
СЧ м
00 и
01 о
«4
СО о о
О (и (Ч (4 т
«4 м о
0 с
СЪ со
О
СЧ \ и (,Ъ о .ч (О
l (, о (ч
0 (т
«т г 1 и (Ъ «
\ и ф
Сl о ф г х о
СО з
О, I/ с ак ф о о
-/ о
Г«
ГЧ О и
О (ч О
О и л
СЧ ф «
С !
Сч П
In
Ф
«т
* СО и т ф и ъо
° О.Т (тъ сч и г ъо (\ сч и
О о п
СЧ Т ( (О
0 с4 т о
l ао ((4 Т (1
CO с и л и (Ъ м и
СЧ
ГЧ
О и о
СЧ
Т Т (/1 о
СЧ О
С Ъ
l0 и о ф ! (1 к о ф r
V «4
v u! о о
О м
Г Г о
О И
01
ГЧ и
-Т
-Т
ГТ л и ь» о
Г»с
5 л
ГЧ
Г 4 и о
Г Г
ГТс.
Т л ь о
4 4
ГЧ
ГЧ
Г3 Cl о о м л ьл 4 о
ЧТ о
О
lIl
О
Ф
ГЧ
Г
\ сР о
40 л
ГЧ
1 1
40 ь л О о
ГЧ
ГЧ .9
О и
Г4 л
ГО
Ю
l . 4
Ch и О
4 4 о и
f л
С44
A и
94
ГЛ м
491
4\ Q м о
Т
4 4 и ь» м
О1
0% ь Г о
ГЧ о
О м
Г 4 о
Г ь 4О
Т
ГЧ
4 Ъ
Ю О
4 4
lJ\ I
4 3
ГЧ
С4
«Т
ГО 44 ь о
ГЧ (7 и о л м
Ч»
* ъО ь» о и
94
ГТ
ГО
4Л о м
4 4
44 О
ГО
ГО
Г
ГЧ и
Ч»
ГГ»
94 о л
4Л и
Ю л
О
-9
4 4 ьО о о л
ГХ
4 Ъ
Г 4
44
4 4
l сл о
Г« л
CV
CQ 4=
ГО м
Ю
Vl о
Т
m 4»
О м
Г м
4 1
«О и
v л
МГ\
ГЧ
Т
ГТ
ГЧ
l о
Г \
Г
ТЧ о
ГЧ М о
Г
UO о
Г4 ал
О
О о.Т о
1м а и
4 4
ТI
Т «»
ГЧ
Т
Г Ъ
ГЛ
О
О
О ю
-Т
О
Ю
ГО
\/1 л
M м3
4»
M и 4» ь»
Г \ л
Г \
ТТ
4l о х
V х с х х
ill О .& о
4 х х х х
У а
& х х с
0 Z х х
Г4 х и о
Х Г1
-.с Х л м х х
Э х х
Г"
4l
ГЦ X
ГЯ
4 Х х х ( о х
У T
L 4»
X х с х
Ю х ф х х
Г4
4Т Л у
t6
Ф
44 O
Ф Ц и и о х
Ol о
Ф о х и
44 О, х х
О 44 х х ь»
Ю м А
;О! 291 027 с .R х х х
1291027
Ос
Г Г гч
СО
+ 4
CV
ГО
О
ГЧ
4 +
+ + м
Г3 г
Л
СЧ
e + +
Ф Ф Ф
+ I
+ + г»
СО с
СО
С
Ю
CO г
СЧ
C I
Ю
С 3
+ + I
Ф ОГ г»
+. 4
+ +
Ф
СО г
+ + г Ч
Ф
ГО
° ГГ м
+ 4
Ю
СЧ сч
4 + 4
Ю
СО
4 + f х и ll
О 5 х л с и
i 3
О F
3 о
X х х
О и х
О О
Ф l х 0
Х Q
«3 О
Э 33 а о
Е ХXX
I» Х
О ВЗ о х
I» L и о х х
X о
С6 о и х о о х = ае л33 хх иа
f о и
Х о х
X х л
Itt о ц а о
Х (1
ttt ttl
3- Ю и
3 ttt х
v О ххх а о ttt апй
I» д и л
3 Л О
vлх
0V» хаас х о
Х Х3 х
X О х
X.с
+ и
v x
Х Х X
О О X
X CI
U - О с- x a л х х и X а 1
Ф
z л с
X а
О х с3 с3
"I о
Х
X Х х х х
О
3 л н
4 о
З О
Б
v о о о
О и и х
0 Х
Г
I» а
Х
СГ х Ф
Е о л х
С
J х у о с
Й с и о х
М с о х
X с а
Э
ФГ И
Х
О х
7. х х
c7l 1 1
СЧ,! с !
О !
3 с,3
1t I й!
О 3
Г3 3 о о. с.
1!
I!
1!
1!!
t
I а
I Е
О.
1
1!!!
C
I!
I
1
1
t3
1 Ц
I 43
i О
3 Х о
I Ю!!
I! C0 I
3 I
I 1.
3 3!
1 — 1
I;,о i
1 „1
ГС
3
1 3
1! — !
1 С-!
3 3
3 3
1 1
1 I
1 3
С 4 3
I
i! I
I 1
3 3
3 3!! t-0. !
I I
l !
I !
1 1
СЗГ I
L !
I I
I l
tt3 1
1 I!
1 I
1 I
t!! 1
1 3
3 I
1 3
I! ю! Л
1 I!
3 3
1 I
1 — — 3!! с1! —
t I!
I
1!.!
I.
1!
Ф
3 + + Ф Ф +
+ + +
+ Ф Ф + Ф +
+ + +
4 1 4 с + +
+ + + Ф Е + Ф + 4
+ + + + 1 Ф + + +
+ + Ф Ф Ф
+ + l Ф l + +
1 Ф 3 + + + + +
+ + +
1 + 4 + +
+ + +
1 + I + 4 + Ф
4 + +
3 4 + + 4
+ +
I + 3 + + 4 Ф
+ 4 +
I 4 I + Ф 4
4 4 +
I + I + Ф Ф + 4
4 +
1 4 I Ф 4 +
+ 4 4
4 i Ф + + + +
4 3 + Ф + +
1291027 (Ч гч
D и о
Ю л о г. го . C
° Ф о о
4 Ъ (Ч о
Э
6
K о с
О
4 о о
Ot о (4 о
Ф о (4
I«t о о о
o o. o
О« с 4 о
Ю э о о
o o (l
-Ф о о
\ о о и
Ю о сг« с
Ю о
Ю
Ct о о о о о о и
Ю
D
« (4
Ю о (\ о и г
Ю
04 (6
Ю о
О
О о.0 гч
Cl о
Ю о
О (л
Ю с о о и
«О
6 о
t о
О«
Ю о
У
Ю
О о
Ю и
Ю ( о
l о
Ю и
Т
О о
C I
О« о в о
l (Ч
« о г г
1
О (Ч и
О щ 61
Э О х х
Э К о Э а. х к
О О
X х
g 44 (6
Э
l6 ,"1 О (} х
О ОХ Э к ОО и
СЭ О Ф
4 Й
w u
О ОХ
Э
Э 5 о х о
z и 6 (- О
u u э х
О К о х о
4 (C х
О 44
Х О Э
l0 С Э
6 В и о
1 1 ах о
С(4 61
CO О
1 « х х I
И хо а х00
Э lt \4
Э О Х
О К g, 4(О
L (д (6(06 л о
f
C1l
О О (Ч
Ч4 л и о (О г ю
6 .S
-6 О
О«
Ю о
О л Ю (С (О .О Ю.0 (О ((« г- .) 1 (О
О
ttÎ х> г о (4
О«
Ч(O
О г (1
X х о
О
Ю (Ч
О (Ч (О х о
A, CO
L (4
I и х х ° о (4 В
6 О
O. CC х х
l0 (6 х о х о
46 Х
К О а О
CI IC
С Э О
Юкц
1 1
Ц О
Э 61 а х
Itt
I 06 а °
О О
О Э а и ф
Э Х 6.
Х Я О х й\
O (U Э
}6 О
О. О
6I Э й(k 1
I о х
Э Х (6 эха а а х (х (ОЭ Э
О
4t C хю64 х
3 Ю"--,=.-Ю 1 о о
Ю с
Ю
o o
Ю Ю О«
О о о о о о о о о о о о с о ю о о
61 Ф
Ф О а
66
66 6l
l, к к (Э I r1 х. 0l
Ю m о о х
Ю
Ю (ч л
0О (С СО о (О СО (О гч и
О} О
СО CO O«
O C4 СЧ
CO CO (О (O Ю
СО СО О
Л г О
CO 0O 0О
И О Л сО (О (О
Л О О (О CO (О со О О (O О С" (1 Cl
t0 а а а
tIt 06
ta г« ( х х х (O, I I
I о о о ю _#_
««(4
Ю
«D
Ю
D о о
Ю
Ю
Ю
lIl
Ю
Ю о
ОО
Ю
Ю
Ю
Ю
О«О
С!
«:«
Ю
О:>
Ю
Ю (С
Ю
Ю
Ю
«D
Ю
Ю
Ю
ОО
Ю
С>
О 1
Ю
ОО
Ю
Ю
Ю
«О
Cl
1
О>
Ф ! х Ф а
С
z о х
X х с
«3
1
1 х
Cl м
WD д «и
Ji х х а
Р C
«О
Х ОО
С
О. °
Ф х
«g
Ф о
Р
Ф х
I» х
О
Ц
Ф
«О
Ф х
Х lIl с о х х z
w z
Ф о «О
О
U
С
Ф
1.
1 1
1 I
4 !
1 — л
3 — 1
} ! —
1" ! О 4 !
1 1
1 1
I i
«
1С
«
— -l
I 1 ! о l
1 I
«Ф
Ф 1 1 1 l к! ! ! (Ф х х
« 1
Ф и а
«О О
Ф z
С
tl
Ф и х
Е В
ct х
Ф
Ц О1
«О Х
X O.
Я Ю
z x
«О
Ф 0 с«йа« е о о х е хо о «ч
O 1. Ol х X
««t ! а. э
П С
1
I!
1
I
1
I
l
I
1
1 а
1 х
1 Х
1 О1
1 11 о
l X,О
1 Ф
Ф
1 «tl
1 м
1 °
Ф х
1 х
z х
1 le
1 х
l 6 а а
1 О«
I X
1
1 al
I X
I 40 х
1 Х
Ф!
1
