Питательная среда для получения рестриктирующих эндонуклеаз из бактерий рода наеморнilus

 

Изобретение относится к микробиологии и молекулярной биологии, в частности к получению рестрикционных эндонуклеаз. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта. Питательная среда состоит из ингредиентов, включаюших источник азота, источник витаминов НАД, гемин и соль. В качестве азотного питания используют аминопептид - ферментативный гидролизат крови животных, и кислотный гидролизат казеина средней степени расщепления, α в качестве витаминного препарата - экстракт кормовых дрожжей (ЭКД). Питательная среда имеет следующий состав, мас.%: аминопептид 0,35-0,45

гидролизат казеина 0,35-0,45

ЭКД 0,1-0,2

НАД 0,0002

гемин 0,001

хлористый натрий 0,1-0,15

дистиллированная вода остальное. Предлагаемая среда позволяет повысить выход ферментов рестрикции более чем в 10 раз по сравнению с известной средой. 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4292496/28-13 (22) 30.07.87 (46) 15,05.89. Бюл. ¹ 18 (71) Центральный научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова (72) В.М.Поляченко, В.А.Мельникова, И.М.Грубер, Э.-Л.И.Кюдулене, Б.M.Ðàñêèí и Г.А.Смирнова (53) 577. 14(088.8) (56) Kilan М., The prokariotes, А.

handboo R. on habiotats isolation

and indentification of bacteria

ed. N.P.Starr е.à. Springer. Uerlag, 1982, v. 2, рр. 1371 †13.

M.Takanami, Methods in Molecular

Biology, ed. R.Â.Wickner, 1974, v. 7, рр. 113-124. (54) ПИТАТЕЛЬНАЛ СРЕДА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ

РЕСТРИКТИРУТОЩИХ ЭНДОНУКЛЕАЗ ИЗ БАКТЕРИИ РОДА FIAENOPHILUS (57) Изобретение относится к области микробиологии и молекулярной биолоИзобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии, в частности к получению рестрикционных эндонуклеаз.

Цель изобретения — повышение выхода целевого продукта.

Изобретение заключается в том, что в известной питательной среде, содержащей источник азотного питания, источник витаминов, НАД, гемин и соль, в качестве источника азота ! используют ферментативный гидролизат крови животных (аминопептид) в сочеÄÄSUÄÄ 1479507 д1 (59 4,С 12 N 1/20 //(С 12 N 1/20, С 1? R 1:?1) гии, в частности к получению рестрикционных эндонуклеаэ, Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта. Питательная среда состоит иэ ингредиентов, включающих источник азота, источник витаминов НАД, ГЕМИН и соль. В качестве азотного питания используют аминопептид — ферментативный гидролизат крови животных, и кислотный гидролизат казеина средней степени расщепления, а в качестве витаминного препарата — экстракт кормовых дрожжей (ЭКД). Питательная среда имеет следующий состав, мас,X: аминопептид 0,35-0,45; гидролизат каэеина 0,35-0,45; ЭКД

0,1-0,2; НАД 0,0002; гемин 0 001; хлористый натрий О, 1-0, 15; дистиллированная вода остальное. Предлагаемая М Р .среда позволяет повысить выход ферментов рестрикции более чем в 10 раз по сравнению с известной средой, 4 табл. ф:звй танин с гидролизатом казеина средней степени расщепления, в качестве

HcT o÷íèêà витаминов — экстракт кормовых дрожжей.

Используемый аминопептнд представляет собой ферментативный гидролизат, полученный из крови крупного рогатого скота с помощью гидролиэа поджелудочной железой. Гидролиэат каэеина средней степени расщепления изготавливается иэ казеина путем гидролиза соляной кислотой. — 1479507

45

0,1

0,0002

0,001

0,1 о

Питательную среду приготавливают следующим образом.

Ингредиенты смешивают в заданном соотношении, добавляют дистиллированную воду до 1 л, нагревают до кипения, устанавливают рЕЕ 7,2-7,4, разливают в бутыли и стерилизуют при

121 С в течение 15 мин, В среду добавляют необходимые для гемофилов факторы роста НАД и гемин в количестве 2 и 10 мг/л.

Культивирование штаммов гемофильных бактерий, продуцентов ферментов рестрикции осуществляют в ферментере 15 с рабочим объемом 2 л, а также в бутылях объемом 5 л на аппарате для встряхивания при 60-70 качаний в 1мин, Сбор биомассы проводят в конце фазы экспоненциального роста — начале ста- 20 ционарной фазы.

Рестриктирующую эндонуклеазу получают следующим образом.

Бактериальные клетки собирают и разрушают ультразвуком с последующим 25 центрифугированием при 48 000g в течение 1 ч для получения бесклеточного экстракта, из которого выделяют ферменты рестрикции методом ионообменной хроматографии на колонке с фосфоцеллюлозой P 11 фирмы Батман.

Все процедуры по получению бесклеточного экстракта и выделению ферментов проводят при 4 С. о

Рестриктазную активность определя-35 ют общепринятым методом разделения фрагментов ДНК фага Д в 1..-ном агароэном геле, Пример 1 (оптимальный). Готовят питательную среду следующего 40 состава, мас.%:

Аминопептид 0,4

Гидролизат казеина 0,4

Экстракт кормовых дрожжей (ЭКД) О, 15

НАД 0,0002

Гемин 0,001

Хлористый натрий 0,12

Дистиллированная вода Остальное

Пример 2 (минимальный). Гото- 5< вят питательную среду следующего состана, мас,%:

Аминопентид 0,35

Гидролиэат казеина 0,35

Экстракт кормовых дрожжей

НАД

Гемин

Хлорис тый натрий

Дистиллированная вода Остальное

Пример 3 (максимальный) . Готовят питательную среду следующего состава, мас.%:

Аминопептид 0,45

Гидролизат каэеина 0,45

Экстракт кормовых дрожжей 0,2

НАД О, 0001

Гемин 0,002

Хлористый натрий 0,15

Дистиллированная вода Остальное

Данные по выходу клеточной биомассы и удельной рестриктазной активности на предлагаемой и известной среде для штамма Н, inf.luenzae Rc В-2297 приведены в табл. 1.

Аналогичные данные для штамма-продуцента рестриктаз Hind II, III Н. influenzae Rd В-2072 приведены в табл.2.

Аналогичные результаты получены также при исследовании следующих штаммов: Н. influenzae Rf В-2296 (продуцент рестриктазы Hinf. I), Н. haemoliticus В-1 841 (продуцент рестриктаэ klha I, НЬа II) и Н.aegyptius В-2709 (продуцент рестриктазы

Нае III).

Таким образом, используемая среда может применяться для выращивания различных видов рода kEaemophilus.

Используемая среда обеспечивает выход биомассы, сравнимый с выходом на известной среде, однако содержание ферментов рестрикции в культуре продуцента, полученной на предлагаемой среде, превышает более чем в

10 раз.

Изменение содержания компонентов используемой среды по сравнению с оптимальным вариантом как в сторону уменьшения, так и увеличения, приводит к снижению выхода биомассы.

Данные представлены в табл. 3.

В табл. 4 приведены данные, характеризующие ростовые свойства предлагаемой питательной среды в зависимости от величины навесок используемых ингредиентов и содержание ферментов рестрикции в полученных на этих средах культурах штамма-продуцента

H. influenzae Rc Б-2297. Среда, приготовленная по примеру 1, является оптимальным вариантом и обеспечивает не только максимальную продуктивность по выходу биомассы, но также и максимальную ферментную активность культуры продуцента, 1479507

Таблица1

Питательная среда

Показатели качества сред

Максимальная Ферментативная удельная ско- активность, рость роста, тыс„ед/г ч -

Выход биомассы г/л

565

Предлагаемая (оптимальный вариант) 2, 5 + О, 3

Сердечно-моз говой бульон фирмы Дифко 6, 2 + 1, 1

2,0 + 0,21 0,73 + 0,18

2,2 + 0,18 0,80 + 0,20

78,0 + 5,2

5,0 + 0,5

Т а б л и ц а 2

Питательная среда

Показатели качества сред

Выход биомассы

Максимальная

Ферментативная активность, тыс.ед/г удельная скорость роста, ч г/л

0Л „, Предлаrаемая 22 + 02 2,1 + 0,18 082 + 0,12 300 + 24

Сердечно-мозговой бульон фирмы Дифко 3,8 + 0,21 2,2 + 0,25 0,89 + О, 12 4,5 + 0,7 таблица3

Компоненты

Содержание компонентов, мас.X

Оа35 0,35

0,35 0,35 0,4 0,4 0,4 0,4

4 035 04 04 045

0,3

0,3

Аминопептид

Гидр оп и э ат каэеина

Экстракт кормовых дрожжей

Оптическая плотность культуры

0,35

0>35 0,3

0,3 о,i 0,15 о,is о,i О,1 о,i

0,05 0,05 О,1 о,i

0,9+0,18 1>2т0>2 1,35+0 ° 19 1,38+0>22 1,56-0>19 1>85+0,25 1,7+0,28

Доэы, обеспечила»а>ие попожнтельныб:>ф>5ект

0>46+0>15 0,52+0, 18 0>83+0> 2

Выход биомассы недостаточен

Фор мула из обретения

Питательная среда для получения рестриктирующих эндонуклеаз из бактерий рода Haemophi.lus, содержащая источник азотного питания, источник витаминов, НАД, гемин, хлористый натрий и дистиллированную воду, о т л ич а ю щ а,я с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, она содержит в качестве источника азотного питания ферментативный гидролизат крови животных в сочетании с

> кислотным гидролизатом казеина средней степени расщепления, а в качестве источника витаминов — экстракт кормовых дрожжей при следующем соотношении компонентов, мас.7:

Ферментативный гидролизат крови животных 0,35-0,45

Кислотный гидролизат казеина 0,35-0,45

Экстракт кормовых дрожжей 0,1-0,2

НАД 0,0002

Гемин 0,001

Хлористый натрий 0,1-0,15

Дистиллированная вода Остальное

1479507

Лродолкение табл,3

Содержание компонентов, мас.1

Компоненты

0,45

0,45 - 0>4

0 l

0,45

0,5

045 05

0,45

0,45 0,45

0 5

0,4

0,4

0,45

0,45

0,4

0,45

0,15,0,15

0,2 0>2 0,2 0,2 0>2

0,2

0,25 плотность культуры

0 > 95т0> 19 0,86> 0 > 21 О, 79+0 ° 15

Быход биомассы недостаточен

Таблида 4

Ферментативная активность тйс, ед/г

Состав питательной среды> мас.X .

Выход биомассы

Максимальная удельная скорость роста, Ч

Г/Л

ОД

Аминопептид

0,73 i 0,18

78,0 g

0,4

0>15 2>5 + 0 ° Э 2>0 Т 0>21

0,4

5,2

0,2

0,2

Оь! 1ь02 Т 0>21 0>72 t 0> 15 0>21 0 ° 0"

8,21 1,5

14,7 и

43>2 i 4,1

0,8

0,8

0,5 0,7 + 0,16 0,5 + О,1 . 0,4 t 0,12

0,25 0,9 2 0 ° 11 1,0 2 0,15 0 ° 44 2 0,14, 0,8

0,8 о

Составитель П. Ходарев

Техред И. Ходанич Корректор A.0бРYчаР

Редактор N ° Håäoëóæåíêo

Заказ 2504/25 Тираж 50,1 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская набьэ д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул, Гагарина,101

Аминопептид

Гидролиавт каееина

Экстракт кормовых дроэскеь>

Оптическая

1,72+0>2 1,76+0,31 1,6+0,18 1,61+0,22 1>5 0>17 1,05т0>2

Оптимальный вариант. .Запредельные варианты

То 3:e