Способ определения диеновых конъюгатов в биологическом материале

 

Изобретение относится к способам определения продуктов перекисного окисления липидов, а именно к способам определения первичных продуктов липопереокисления - диеновых конъюгатов полиненасыщенных высших жирных кислот /ацилгидроперекисей липидов/. С целью повышения чувствительности и упрощения способа проводится экстракция жирных кислот гептан - изопропанольной смесью в присутствии раствора соляной кислоты, которая осуществляется в течении 3-3,5 мин, а после завершения экстракции в смесь вносят 6%-ный раствор додецилсульфата натрия в соотношении 2,5:1 - 4,0:1 к белку исследуемого биологического материала. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ.

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) 6 А1 (51) 4 G 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

3Г 1 Я Щ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

° К ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4171890/28-14 (22) 04.01.87 (46) 30.05.89. Бюл. Р 20 (71) Белорусский научно-исследовательский институт кардиологии (72) В.В.Мирончик, Т.П.Куртасова, С.Л.Анищенко и А.П.Сараева (53) 612.015(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

N- 1018014, кл. С 01 N 37/48, 1987. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДИЕНОВЫХ

КОНЪ10ГАТОВ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ (57) Изобретение относится к способам определения продуктов перекис.ного окисления липидов, а именно к

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для определения интенсивности свободнорадикального окисления липидов в биологическом материале.

Цель изобретения — повышение чувствительности при одновременном ускорении способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Биологический материал в объеме

0,2 мл помещают в пробирку с плотно фиксируемой пробкой, добавляют 4 мл гептан-пропанолъной смеси (l:1) и 1мл раствора HCf с рН 1-2, закрывают пробкой, интенсивно встряхивают 33,5 мин, затем добавляют 1 мл 4Х-ного раствора додецилсульфата йатрия (из расчета 2,5-4:1 к белку пробы по весу) и 2 мл гептана, встряхивают

0,5-1 мин. Через 10 мин после рассло- . ения смеси отбирают верхний гептано2 способам определения первичных продуктов липопереокисления — диеновых конъюгатов полиненасьпценных высших жирных кислот (ацилгидроперекисей липидов). С целью повышения чувствительности и упрощения способа проводится экстракция жирных кислот гептан-изопропанольной смесью в присутЮ ствии раствора соляной кислоты, которая осуществляется в течение 33,5 мин, а после завершения экстракции в смесь вносят 6Ж-ный раствор додецилсульфата натрия в соотношении

2,5:1-4,0:1 к белку исследуемого биологического материала. 2 табл. вый слой и измеряют оптическую плотность при 233 нм.

Содержание диеновых конъюгатов жирных кислот (ЖК) выражают в величинах оптической плотности при 233 нм на 1 мл плазмы крови, 1 мл эритроцитов, 1 г ткани..

Пример l. Определено содержание диеновых конъюгатов ЖК в плазме и эритроцитах крови здорового мужчины С., 35 лет, Диеновые конъю— гаты плазмы крови = 3,30 (Д /мл плазмы); диенконъюгаты эритроцитов = — 2, 48 (g Д /мл эритроцитов ) .

Пример 2. Определено содержание диеновых конъюгатов в плазме и эротрицитах крови у больного P. мужчины 46 лет. Диагноз: ишемическая болезнь сердца. Стенокардия напряжения, Атеросклеротический кардиосклероз.

Атеросклероз аорты, коронарных артерий. Н . Желудочковая экстрасистолия.

1483376

Таблица 1

Время инкубации, мин

1 I t. 1

Показатель

10 15 30

Диеновые конъюгаты ЖК Д з »

228 586 907 601 3 95

Среднее арифметическое пяти параллельных опытов

Таблица 2

2,5:1 3,0:1 3,5:1 4,0:1 4,5:1

ДДБ-Ма/белок Д . (пробы)

4Дюм %

0,246 0,250 0,260 0,258 0,244

94,7 96,2 100 99,6 94,0

Среднее арифметическое пяти параллельных опытов.

Диенконъюгаты плазмы крови = 6,00 (Д /мл плазмы); диеновые конъюгаты эритроцитов = 4,80 (Q Д /мл эритроцитов).

Пример 3. Исследована динамика содержания диеновых конъюгатов в интактной митохондриальной фракции печени крысы и фракции митохондрий, инкубированной при 37 С в присутствии 10

0,1 мм Ге04, что приводило к активации СПОЛ в начале инкубации, а через

10 мин к его торможению (табл.1).

В табл.2 представлены данные, характеризующие рабочий диапазон экст- 15 ракции диеновых конъюгатов жирных кислот в зависимости от нарастающего соотношенйя додецилсульфата натрия (ДДЯ-На) к белку плазмы крови в мг. 20

Как видно из табл,2, максимальная экстракция диеновых конъюгатов ЖК наступает при соотношении ДД$-Na/áåëîê

3,5:1, но в пределах 2,5:1-4,5,1. Оп-. ределение диеновых конъюгатов достоверно не отличается от условий максимальной экстракции.

В предложенном способе определения содержания диеновых коньюгатов жирных кислот в биологических тканях чувствительность по сравнению с прототипом возросла более чем в 3 раза (на 35% за счет добавления раствора HCf в гептан-изопропаноловую смесь до экстракции и на 285% за счет введения в смесь после экстракции 4%-ного раствора ДДЯ).

Предлагаемый способ обеспечивает высокую чувствительность, хорошую воспроизводимость, а также быстр и прост в осуществлении.

Способ может быть использован в научных, экспериментальных, биохимических и клинических исследованиях.

Формула изобретения

Способ определения диеновых конъюгатов в биологическом материале путем добавления к исследуемой пробе гептан-изопропанольной смеси, соляной кислоты, гептана для расслоения фаз, встряхивания с последующим спектрофотометрированием гептаиовой фазы при 233 нм, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения чувствительности при одновременном ускорении способа, соляную кислоту добавляют одновременно с гептанизопропанольной смесью, встряхивают, затем дополнительно добавляют раствор додецилсульфата натрия, который вносят вместе с гептаном, при этом додецилсульфат натрия используют в соотношении (2,5-4, 0):1 к белку пробы,