Способ получения антибиотика а 42125 и штамм микроорганизма nocardia aerocolonigenes - продуцент антибиотика а 42125

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству антибиотиков. Антибиотик А 42125 получают путем культивирования штамма NOCARDIA AEROCOLONIGENES NRRL 18049 в анаэробных глубинных условиях при перемешивании в питательной среде, содержащей источники углерода и азота и минеральные соли. Целевой продукт может быть использован в виде обезвоженной культуральной жидкости либо в виде чистого антибиотика. Для этого отделяют жидкую фракцию культуральной жидкости, полученный фильтрат подвергают экстракции и очищают антибиотик хроматографическим методом. Эмпирическая формула C<SB POS="POST">101</SB>H<SB POS="POST">184</SB>N<SB POS="POST">2</SB>O<SB POS="POST">38</SB>, элементарный анализ, % : C 59,51

H 9,05

N 1,44

O 30,08. 2 с. и 1 з.п. ф-лы.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ fHHT СССР (2)) 4202303/30-13 (22) 07.04.87 (31) 850786 (32) 11.04.86 (33) US (46) 28.02,90. Бюл. № 8 (71) Эли Лилли энд Компани (US) (72) Роберт Л.Хэмилл и Ральф Эмиль

Кастнер (US)

i (53) 615. 779. 93 (088. 8) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА

А 42125 И UITAMN ))И1<РООРГАНИЗМА NOСАВЭЕА АЕКОСОЕОИТСЕИЕБ — ПРОДУЦЕНТ

АНТИБИОТИКА А 42125 (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частноИзобретение относится к микробиологической промышленности, в частности производству антибиотиков °

Антибиотик A 42)25 проявляет антимикробную активность в отношении микроорганизмов, продуцирующих метан, Антибиотик повышает эффективность питания, промотирует рост жвачных животных, Продуцентом антибиотика является штамм Nocardia aегоcolonigenes А 42125, который выделен из почвенного образца из Бразилии. Штамм депонирован под номером NRRL 18049 и характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки, Культура продуцирует экстенсивный субстрат и хорошо развитый воздушный

ÄÄSUÄÄ 1547716 А 5 (5!) 4 С )2 P 1/06//(С 12 P )/06

С 12 R 1:365) сти к производству антибиотиков ° Антибиотик А 42125 получают путем культивирования штамма Nocardia atrocolonigenes NRRL 18049 в анаэробных глубинных условиях при перемешивании в питательной среде, содержащей источники углерода и азота и минеральные соли. Целевой продукт может быть использован в виде обезвоженной культуральной жидкости либо в виде чистого антибиотика. Для этого отделяют жидкую фракцию культуральной жидкости, полученный фильтрат подвергают экстракции и очищают антибиотик хроматографическим методом. Эмпирическая формула С„„ Н,z< N O g, элементарный анализ, %: С 59,51; Н 9,05; И 1,44;

О 30,08. 2 с, и 1 з ° п.ф-лы. мицелий. Воздушные гифы имеют вид паутинны. Конидиинаблюдают при помощи растровой электронной микроскопии.

Споры образуются слабо и нерегулярно.

Орнаментация поверхности спор гладкая, Форма спор от продолговатой до цилиндрической, образуют цепи из более чем

50 единиц. Размер спор варьирует от

1,2-0,9 х 0 5-0,4 мкм, в среднем 1,1х х 0,5 мкм, В условиях глубинного роста со встряхиванием гифы разделяются на фрагменты.

Среда МПС2 — рост обильный, субст- 4Р ратныи мицелии 78.d yBrI (здесь и далее цвет приведен в системе Tresner и Bachus); воздушный мицелий обильньш, 5fel.gy.rBn. Растворимый пигмент светло-коричневый.

1547710

Среда МПСЗ вЂ” рост хороший, субстратный мицелий 89,р..У4; воздушный ми1, целий обильный, Ь, жемчужно-белый, Растворимый пигмент отсутствует, Среда МПС4 — рост хороший; субстратный мицелий 77.т,yBr воздушный мицелий хороший, светло-серый, Растворимый пигмент отсутствует °

Среда МПС5 — рост обильный; субст- 10 ратный мицелий 77.m.yBr5; воздушный мицелий ббильный, жемчужно-белый. Растворимый пигмент отсутствует.

Малат кальция — рост хороший; субстратный мицелий 77.m.yBr; воздушный 15 .мицелий хороший, 1, жемчужно-белый, Растворимый пигмент отсутствует;

Агар с раствором Чапека — рост хороший; субстратный мицелий 77.m,уВх; ,вбздушный мицелий хороший, d, светло- 20 серый, Растворимый пигмент слабо светло-коричневый.

Глюкозо-аспарагиновая среда — рост хороший; субстратный мицелий 89,р.У; ,воздушный мицелий слабо развитый, d 25 светло-серый. Растворимый пигмент от— сутствует.

Агар с водопроводной водой — рост хороший, субстратный мицелий 92.у

white 8; воздушный мицелий обильный, 30

1Ь, жемчужно-белый. Растворимый пиг) мент отсутствует.

Дрожжево-декстрозный агар — рост обильный, субстратный мицелий 78,d.Br; воздушный мицелий не развит (морщинистая поверхность.). Растворимый пигмент светло-коричневый.

Физиолого-биохимические свойства, Разлагает казеин, эластин, гуанин, гипоксантин, тирозин, 40

Гидролизует малат кальция, ДНК, зскулин и крахмал, Сбраживает до кислоты арабинозу, целлобиозу, фруктозу, галактозу, о(метил-Д-гликозид, глюкозу, глицерин, инозит, лактозу, мальтозу, маннит, маннозу, мелибиозу, рафинозу, рамнозу, трегалозу, ксилозу, Утилизирует ацетат, бензоат, цитрат, малат, оксалат, пропионат, пируват, сукцинат и тартрат, Продуцирует каталазу, фосфатазу, протеиназу, уреазу, меланоидные пигменты.

Устойчив к концентрации NaC1 до б, Гидролизует латекс без "сливок", Восстанавливает нитраты в нитриты, Растет при температуре от 15 до о

37 С, погибает при воздействии температуры 50 С в течение 8 ч.

Устойчив к лизоциму, цефалотину, гентамицину, линкомицину, пенициллину и тобрамицину, чувствителен к рифампину.

Способ получения антибиотика А

42125 иллюстрируется следующими примерами, Пример 1. Биосинтез антибиотика.

Штамм Nocardia aегоcolonigenes

NRRL 18049 в виде лиофилизированной гранулы или суспензии, сохраняемой в жидком азоте, высевают на скошенный агар следующего состава, г/л:

Картофельный декстрин 10

Дрожжевой экстракт 1

Ферментативный гидролизат казеина 2

Мясной экстракт 1

СоС1 6Н 0 0i01

Агар 20

Деионизированная вода, л 1 рН регулируют от 6,2 до 7,0 с помощью раствора NaOH.

Инокулированный скошенный агар инкубируют при 30 С в течение 7 дн ° 3peлую культуру на скошенном arape соскабливают стерильным инструментом для разрыхления спор и извлечения и мацерации мицелиальной пленки, Около

1/4 разрыхленных споф и полученную таким образом культуру используют для инокуляции 50 мл вегетативной среды, имеющей следующий состав, г/л:

Глюкоза 15

Маниочный декстрин 20

Група сои культурной 15

Кукурузная мерсеризационная жидкость 10

Дрожжевой экстракт 1

СаСО> 2

Водопроводная вода, л 1

Инокулированную вегетативную среду инкубируют в 250:лл колбе Зрленмейера о при 30 С приблизительно 72 ч на ка чалке со скоростью 250 об/мин, Эту инкубированную вегетативную среду (1 25 мл) используют для инокулирования 50 мл продуктивной среды, имеющей следующий состав, г/л:

Глюкоз а 25

Кукурузный крахмал 10

15477

5

0,5

2,0

Растворимый мясной пелтон 10

Ферментативный гидролизат каэеина

Сырая меласса

МИВ Ф 2

СаСО

Минеральная смесь

Чапека» мл 2

Деиониэированная во.= да, л 1

Минеральная смесь Чапека имеет следующий состав: 100 r КС1, 100 r МАМБО+»

«7Н,О, 2 г FeS0 7!1,О, до 1 деионизированной воды.

Инокулированную продуктивную среду инкубируют в 250 мл широкогорлой колбе Эрленмейера при 30 С в течение периода от 3 до 5 дн на качалке со 20 скоростью 250 об/мин.

Для того чтобы получить большой объем инокулянта,, 10 мл инкубирован-. ной вегетативной среды, полученной, как описано выше, используют для ино- 25 кулирования 250 мл двухстадийной среды для выращивания, имеющей такой же состав, что и вегетативная среда, Эту двухстадийную среду инкубируют в

2-литровой широкогорлой колбе Эрлен- 30 мейера приблизительно "0 ч при 30 С на качалке со скоростью 250 об/мин, Полученную таким образом инкубированную двухстадийную среду (400 мл) используют для инокулирования 100 л стерильной продуктивной средь, полу-,. ченной, как описано выше. Брожение проводят в 165-литровом бродильном чане в течение периода от 3 до 5 дн при 30 С в условиях перемешивания.

Низкий расход воздуха (0,12.-

0,25 об/мин} и умерененная скорость вращения (200-250 об/мин) в мешалке поддерживают уровень растворенного кислорода на 307 Выше Воздухонасыще 45 ния.

Пример 2. Выделение антибиотика А 42125.

Весь ферментационный бульон (92 л), содержащий 3 . Hyflo Supercel, фильтруют через фильтр-пресс. Бульонный фильтрат (74 л) доводят до рН 7 посредством NaOH. Прибавляют смолу Диаион HP-20 (9,4 л), Смесь перемешивают в течение 45 мин и отфильтровывают, Фильтрат удаляют и смолу промывают

3 раза. водой (каждый раз 10 л) и три раза смесью ацетонитрил:вода 3:17 (каждый раз 10 л), ресуспендируя, пе! о 6 ремешивая и фильтруя, Промывки удаляют. A 421 25 элюируют, суспендируя смолу в смеси ацетонитрил:вода (1:1, 10 .л), перемешивая и фильтруя. Осуществляют четыре последовательных элюирований, и каждую фракцию элюата ана". лизируют с использованием метода дисков Micrococcus luteus для количественного определения антибиотика, Первые два элюата объединяют, концентриРуют в вакууме для удаления ацетонитрила и сушат вымораживанием с получением 94,9 г сырого А 42125. Из третьего элюата получают 20,8 г сырого

А 42725, Пример 3. Очистка и кристаллизация А 42)25.

Неочищенные препараты А 42125, полученные в примере 2, объединяют (ll5,2 г) и растворяют в воде (3 л).

Раствор фильтруют для удаления осадка и фильтрат подводят к колонке, содержащей 3 л Dowex 50 х 2 (NH"), 100—

200 меш,смола, Колонку промывают последовательно пятью объемами колонки воды и 0,1 н. раствором NH OH. Фракции от элюирования 2 н. !1Н ОН,содер жащие наибольшие количества A 42!25, объединяют и концентрируют до объема около 3 л П 42125 осаждают и разделяют фильтрацией. Осадок растворяют в метаноле (300 мл) и этот раствор прибавляют к эфиру (6 л) для осаждения

А 42125. Этот осадок фильтруют и сушат с получением 16,6 г А 42125 в виде аморфного порошка. Второй осадок получают последующей концентрацией водного раствора и обработкой его аналогичным образом с получением 20,7 г менее чистого А 42125, Первый А 42125 (16,6 г) растворяют в теплой воде (800 мл}. Этот раствор отстаивают в течение ночи при комнатной температуре и А 42125 кристаллиэуют. Кристаллы разделяют, фильтрацией и сушат в вакууме с получением 10,6 г и 2,3 г (второй сбор) кристаллического

А 42125.

Характеристика антибиотика.

Состояние: белые кристаллы (из воды).

Т.пл.: 149-150 С.

УФ: поглощение отсутствует.

ИК (КВч): показывает поглощение при следующих частотах (см .) — широкий пик, который включает 3423, 34!3, 3409, 3403, 3398 и 3386; 2937, 1720, !

602, 1453, 1408, 1379, 1290, 1192, 1547710

Для корма скота может быть использован не только чистый антибиотик, но и вся культуральная жидкость без экстракции или разделения, после отделе- ®0 ния воды, т.е. обезвоженная культуральная жидкость. Высушенную различными способами культуральную жидкость перемешивают с питательным премиксом.

Пример 4, Рацион крупного ро- <5 гатого скота, усиленный А 42125.

Сбалансированный. рацион с высоким содержанием зерна, предназначенный для скота, готового к переработке, получают по следующему рецепту, :

Кукуруза, желтая 50,25

Стержни кукурузного початка 34,927

Люцерновая мука„ дегидратирован55 ная, 17

4,00

1120, 1090, 1064, 971, 870, 830 и

802 °

Титрование (80%-ный водный диметилформамид): степени кислотности 5,2, 8,7 и 10,5.

Мол.масса: 2032 (масс-спектрометрия полевой десорбции).

Эмпирическая формула: С, „H,q,N O ..

Элементарный анализ: углерод 59,51,!О водород 9,05, азот 1,44, кислород

30,08.

Аминокислоты не обнаружены.

Растворимость: растворим в воде.

Биоавтография: с использованием 15 ватманской бумаги 11 - 1, пропитанной

0,95 H Na SO и NaHSO< H O, системой растворителя — 80 .-ro водного этанола, содержащей 1,5 . NaC1, с помощью тест-культуры Nicrococcus luteus, най-N дено, что Rf приблизительно 0,46.

На основании характеристик титрования антибиотик может содержать карбоксильную группу, фенольную группу,,которые могут образовывать соли — натриевые, калиевые, литиевые, цезиевые, рубидиевые, бариевые, кальциевые и магниевые; аммониевые, первичные, вторичные и третичные С -С -алкиламмониевые и окси — С -С4-алкиламмоние30 вые; аддитивные соли, образованные стандартными реакциями как с органическими, так и неорганическими кислотами.

Соевый шрот, экстрагированный растворителем

Мочевина, кормовой сорт

Меласса тростниковосахарная

Дикальцийфосфат

Соль

Карбонат кальция

Микроэлементный ми.неральный премикс

Премикс Витамин

А и Д

Премикс Витамин Е

Антибиотик

А 42125

4,00

0,35

5,0

0,65

0,35

0,30

0,03

0,07

0,07

0,003

100,00

Микроэлементный минеральный премикс содержит, : 2,50 марганца в виде окиси марганца, 0,07 йода в виде йодида калия, 0,03 кобальта в виде карбоната кобальта, 0,5 меди в виде окиси меди и 20 цинка в виде сульфата цинка.

Использование способа позволяет получить новый антибиотик, который проявляет активность в отношении микроорганизмов, продуцирующих метан, что повышает эффективность питания животных и промотирует рост у жвачных животных.

Формула и з о б р е т е н и я

1. Способ получения антибиотика

А 42125, заключающийся в том, что штамм Иосагд à aегоcolonigenes NRRL

18049 культивируют в анаэробных глубинных условиях при перемешивании в питательной среде, содержащей источник углерода и азота и .минеральной соли, с последующим выделением целевого продукта из культурадьной жидкости.

2. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью получения чистого препарата, культуральную жидкость фильтруют, а фильтрат подвергают экстракции и очищают целевой продукт хроматографическим методом.

3. Штамм микроорганизма Nocardia

aегоcolonigenes NRRL !8049 — продуцент антибиотика А 42125.