Способ определения управляющих коэффициентов подсистем окисления и фосфорилирования системы окислительного синтеза атф

 

Изобретение относится к биохимии и к биофизике и может быть применено при излучении in vitro регуляции окислительного фосфорилирования как энергетическими метаболитами, так и различными химическими и фармакологическими агентами. Целью предлагаемого изобретения является упрощение, повышение точности и расширение диапазона применения способа определения управляющих коэффициентов подсистем окисления и фосфорилирования за счет использования инкубационных сред с различной буферной емкостью. На фоне фосфорилирующего дыхания митохондрий в инкубационную среду добавляют ингибитор олигомицин в концентрации, вызывающей полное ингибирование дыхания, затем добавляют разобщитель в последовательно повышающихся концентрациях, скорость разобщенного дыхания опредепяют для каждой концентрации разобщителя, затем определяют управляющие коэффициенты подсистем окисления и фосфорилирования аналитически или графически. 2 табл. СО С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5!)5 С 12 0 1/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4667304/13 (22) 27.03.89 (46) 15.03,91. Бюл. ¹ 10 (71) Горьковский медицинский институт им. С.М.Кирова (72) Е.М,Хватова, П.П.Загоскин и В.Н.Самарцев (53) 577.31 1.347(088,8) (56) Westerhoffetal. On the origin of the

limited control of mitochondrial respiration by

the adenine nucleotldetranslocator, -Arch

Biochem Biophys 1987,ч, 257. ¹ 1, р. 154169. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УПРАВЛЯЮЩИХ КОЭФФИЦИЕНТОВ ПОДСИСТЕМ

ОКИСЛЕНИЯ И ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ

СИСТЕМЫ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СИНТЕЗА

АТФ (57) Изобретение относится к биохимии и к биофизике и может быть применено при излучении in vitro регуляции окислительноИзобретение относится к биохимии и к биофизике, а именно к биоэнергетике.

Цель изобретения — упрощение и повышение точности способа.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Сравнительное определение управляющих коэффициентов подсистем окисления и фосфорилирования графическим и аналитическим методами.

Выделяют митохондрии из мозга крыс самцов общепринятым методом дифференциального центрифугирования, В холодной камере (Π— 4 С) животных декапитируют, извлекают из черепной коробки полушария головного мозга и помещают их в стакан объемом 100 мл, заполненный охлажденной

„„Я „„1634718 А1 го фосфорилирования как энергетическими метаболитами, так и различными химическими и фармакологическими агентами.

Целью предлагаемого изобретения является упрощение. повышение точности и расширение диапазона применения способа определения управляющих коэффициентов подсистем окисления и фосфорилирования за счет использования инкубационных сред с различной буферной емкостью. На фоне фосфорилирующего дыхания митохондрий в инкубационную среду добавляют ингибитор олигомицин в концентрации, вызывающей полное ингибирование дыхания, затем добавляют разобщитель в последовательно повышающихся концентрациях, скорость разобщенного дыхания определяют для каждой концентрации разобщителя, затем определяют управляющие коэффициенты подсистем окисления и фосфорилирования аналитически или графически. 2 табл. (О С) средой выделения следующего состава: сахароза — 250 мМ, трис 2,5 мМ, трис-HCI

8,5 мМ, ЭДТА 1 мМ, рН 7.4. Затем полушария головного мозга очищают от мозговых оболочек и кровеносных сосудов, промывают и гомсгенизируют с помощью тефлонового пестика со скоростью 200 об/мин, произведя 10 движений пестиком внизвверх. Гомогенат разводят до соотношения

1:10 и центрифугируют 10 мин при 1000 g.

После этого надосадочную жидкость осторожно сливают в стакан, разливают по пробиркам и центрифугируют в течение 10 мин при 13000 g.

Потребление кислорода измеряют поля рографически с помощью открытого платинового электрода. Применяют инкуба1634718

Сок и X(pl — (Х(р))2 ционную среду следующего состава: сахароза 250 MM, KCI 15 мМ, трис 10 мМ, КН2Р04

20 мМ, ЭДТА 0,5 мМ, рН 7,4, В качестве субстрата дыхания используют 15 мМ глутамат. После прекращения дрейфа электрода в полярографическую ячейку добавляют суспензию митохондрий объемом 0,04 мл до конечной концентрации белка в ячейке 0,81,2 мг/мл. Через 1 мин после добавки митохондрий в полярографическую ячейку с помощью полуавтоматической микропипетки вносят 0,02 мл 100 мМ раствора АДФ.

Автоматически записывают динамику изменения концентрации кислорода в ячейке.

Убедившить, что зависимость изменения концентрации кислорода от времени линейна, через 1 мин после внесения АДФ с помощью микрошприца в ячейку вносят ингибитор АТФ-синтетазы олигомицин до конечной концентрации в ячейке 200 нгlмл, вызывающей полное ингибирование фосфорилирующего дыхания. После прекращения дыхания добавляют протонофорный разобщитель 2,4-ДНФ последовательно до конечных концентраций в ячейке 5; 10; 20;

40; 80 мкм. Управляющие коэффициенты окисления и фосфорилирования определяют по графику зависимости величины

Чз (р ) — от концентрации раэобщителя

V, (р) и аналитическим методом по фомуле

Сф= 1 — Co, a и X (р) — — — (р),, (р)—

ЧЗ V3

Ч V где чз — скорость фосфорилирук,щего дыхания;

Чр — скорость разобщенного дыхания; (р) — концентрация разобщителя;

n — общее количество добавок разобщителя в процессе эксперимента;

С к — управляющий коэффициент подсистемы окисления;

СФ вЂ” управляющий коэффициент подсистемы фосфорилирования.

Результаты определений приведены в табл. 1 и2, Пример 2. Изучение влияния ротенона на управлящие коэффициенты подсистем окисления и фосфорилирования.

Исследуют влияние ротенона (специфического ингибитора НАДН-дегидрогеназы) на величины управляющих коэффициентов подсистемы окисления и фосфорилирования. Процедуры выделения митохондрий из мозга крыс самцов, а также измерения потребления кислорода митохондриаль5

55 ной суспензией те же, что и в примере 1. В качестве субстрата дыхания используют

15 мМ глутамат+ 5 мМ малат. Как и в случае примера 1, определяют скорость фосфорилирующего дыхания в присутствии избытка

АДФ (2 мМ), затем добавляют ингибитор олигомицин в концентрации, вызывающей полное ингибирование фосфорилирующего дыхания, затем добавляют 2,4-ДНФ в последовательно повышающихся концентрациях 5; 10; 20; 40; 80 мкм и определяют скорость дыхания при каждой концентрации раэобщителя.

Составляют график, по оси ординат которого откладывают численное значение чз выражения (р) — à по оси абсцис-конценv, трацию раэобщителя (р) и определяют управляющий коэффициент подсистемы окисления как тангенс угла наклона экспериментальной прямой. Управляющий коэффициент подсистемы фосфорилирования определяют по формуле

Сф = 1 — Сок

Ротенон применяют в концентрации

35 нМ, вызывающей подавление скорости фосфорилирующего дыхания на 60 .

Тангенс угла наклона экспериментальной прямой в присутствии ротенона равен

0 91, а в отсутствии его 0,68, Следовательно, под влиянием ротенона управляющий коэффициент подсистемы окисления повышается с 0,68 до,091. Следовательно управляющий коэффициент подсистемы фосфорилирования снижается с 0,32 до

0,09. Таким образом, ротенон, ингибируя скорость фосфорилирующего дыхания на уровне подсистемы окисления, увеличивает ее управляющий коэффициент.

Формула изобретения

Способ определения управляющих коэффициентов подсистем окисления и фосфорилирования системы окислительного синтеза АТФ, включающий определение скорости фосфорилирующего дыхания в присутствии высоких концентраций АДФ, добавление протонофорного разобщителя и определение скорости разобщенного дыхания, отличающийся тем, что, с целью упрощения и повышения точности способа, до добавления разобщителя в инкубационную среду вводят ингибитор олигомицин в концентрации, вызывающей полное ингибирование фосфорилирующего дыхания, разобщитель добавляют в последовательно повышающейся концентрации, скорость разобщенного дыхания определяют для каждой концентрации разобщителя и затем рассчитывают управляющие коэффициенты

1634718 подсистемы окисления Со и фосфорилирования Сф по формулам

v3 — скорость фосфорилирующего дыхания;

Чр — скорость разобщенного дыхания, или по графику зависимости величины

5 Чз (р) — от концентрации раэобщителя (р), Vp где управляющий коэффициент пасистемы окисления определяется как тангенс угла наклона экспериме .таль10 ной прямой.

„ () Чз - ; Чз

Сок

V V и (р)2 — ((р) ) где n — общее количество добавок разобщителя в процессе эксперимента; (р) — концентрация разобщителя;

Т аблица1

Таблица2

Составитель Н.Родова

Редактор М,Недолуженко Техред М.Моргентал Корректор О,Кравцова

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 733 Тираж 365 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5