Способ определения пироксидазной активности биологических объектов

 

Изобретение относится к способам биохимического анализа и может быть использовано для определения пероксидазной активности в биологических образцах и в иммуноферментном анализе. Цель изобретения - повышение чувствительности способа. К исследуемой пробе добавляют буферный раствор, перекись водорода и в качестве хромогена смесь гваякола и п-аминодиэтиланилина при концентрации каждого компонента 0,25-0,75 мм. Пробу инкубируют, измеряя прирост оптической плотности во времени. Способ позволяет повысить чувствительность определения пероксидазной активности в 5,6 раз. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 G 01 N 33/52

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

А

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4363857/30-14 (22) 13. 01. 88 (46) 23.03.91. Бюл. Р 11 (71) Львовское отделение института биохимии им.А.В.Палладина (72) М.В.Гончар и А.А.Сибирный (53) 612.016(088.8) (56) Verduin С.,Van Dijken Л.P. Scheffers W.À. — J.Microbiol. Methods, 1984, v.2, р.16. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРОКСИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ (57) Изобретение относится к способам биохимического анализа и может

Изобретение относится к способам биохимического анализа и может быть использовано для определения пероксидазной активности в биологических образцах и в иммуноферментном анализе.

Цель изобретения — повышение чувствительности способа.

Способ осуществляется следующим образом, К исследуемой пробе добавляют буферный раствор, перекись водорода и в качестве хромогена смесь гваякола и п-аминодиэтиланилина при концентрации каждого компонента 0,25-0,75 мМ.

Пробу инкубируют, измеряя прирост оптической плотности во времени.

Пример 1. Анализ пероксидазной активности экстракта хрена.

500 мг измельченного на терке хрена гомогенизируют в ступке, расти„„SU„„1636773 А 1

2 быть использовано для определения пероксидазной активности в биологических образцах и в иммуноферментном анализе. Цель изобретения — повьппение чувствительности способа. К исследуемой пробе добавляют буферный раствор, перекись водорода и в качестве хромогена смесь гваякола и и-аминодиэтиланилина при концентрации каждого компонента 0,25-0,75 мм.

Пробу инкубируют, измеряя прирост оптической плотности во времени. Способ позволяет повысить чувствительность определения пероксидазной активности в 5,6 раз. 2 табл. рая с равным объемом битого стекла с дробным прибавлением 5 мл 5 MM фосфатного буфера, рН 7,0. Полученную смесь цснтрифугируют при 5.тыс.об/мин в течение 5 мин, Супернатант разбавляют в 10 раз. Для анализа в 1 см— кювету вносят 0,2 мл 1 М фосфатного буфера, рН 7,0, по 0,2 мл 5 мМ гваякола и 5 мМ п-аминодиэтиланилина, 0,2 мл разведенного экстракта хрена.

Объем доводят водой до 3,8 мл и реакцию начинают прибавлением 0,2 мл

2 мМ Н О . Через 30 с измеряют прирост оптической плотности раствора при 670 нм за 1 мин на приборе ФЭК КФК-2МП (в кинетическом режиме) при комнатной температуре.

Расчет ведут по формуле

1636? 73

Таблица 1

Концентрация п-аминоКонцентрация гваякола, мМ

Прирост оптической плотдиэтиланилина, мМ ности за

1 мин

0,05

0,5

0,25

0 05

О,S

0,75

1,0

0,05

0 05

0,25

0,5

0,5

0,75

1,0

0,082

0,226

0,251

0,137

0,251

0,308

0,300

ДР и к

V ° t

S5 где д Р/мин — прирост оптической плотности за i мин, К вЂ” калибровочный коэффициент (т.е. количество м оль НХОФ в

4 мл пробы, соответствующее оптической .плотности 1), rr — разведение перед внесением пробы в реакционную смесь, ч — объем вносимой пробы, мл.

В конкретном случае ц П/мин = 0,26, 5

К = 0,35, n = 10, V = 0,2. Тогда А =

= 4,56 мкмоль/мин мл = 0,0456 мкмоль/

/мин мг влажной массы хрена.

Пример 2. Анализ пероксидазной активности очищенного препарата пероксидазы хрена (RZ = 2,7) .

Раствор фермента в воде разбавляют до концентрации 0,25 — 4 мкг/мл и анализ осуществляют по примеру 1.

Исходная концентрация фермента 25

0,5 мг/мл, разбавление 250, объем вносимой пробы фермента 0,2 мл.

AD<>

/мин мл = 170 мкмоль/мин мг.

В предыдущих примерах активность определялась в кинетическом режиме, т;е. прямым измерением прироста оптической плотности за 1 мин. Если соответствующие приборы отсутствуют, в серийных опытах активность пероксидазы можно измерять в режиме определения абсолютной величины оптической плотности растворов (против контроля) предварительно инкубируя пробы в фиксированное время (5 — 30 мин) при 40 комнатной температуре по формуле, мкмоль/мин мл: (. где t - время инкубации, мин.

Остальные параметры аналогичны примеру 1.

Пример 3. Анализ следов гемоглобина ло его пероксидальной ак- 50 тивности, Непосредственно перед опытом смешивают 0,2 мл 1 M ацетатного буфера, . рН 5,3, 0,2 мл 5мМ гваякола, 0,2 мл

5 мМ п-аминодиэтиланилина, 0,2 мл разведенной исследуемой пробы (440 мкг гемоглобина). Объем проб доводят до 2,8 мл водой и реакцию начикают прибавлением 0,2 мл 20 мМ Н О

После инкубации проб при комнатной температуре реакцию останавливают прибавлением 1 мл 0,125 М Na

Допустимые граничные значения концентраций хромогенов приведены в табл.1. Условия: 50 мМ фосфатный буфер, рН 7,0. Концентрация пероксидазы хрена ("Реанол", RZ = 0,6)

0,5 мкг/мл, перекиси водорода 0,1мМ

ФЭК КФК-2МП; 670 нм, 1 см.

Как видно из табл.1, максимальный положительный эффект предлагаемого способа достигается при концентрации хромогенов 0,25-0,75 мМ. При концентрации больше 0,75 мМ чувствителъность анализа не растет, однако увеличивается оптическая плотность контроля.

Чувствительность анализа увеличивается в S,á раза.

Сравнение чувствительности определения пероксидазы хрена по предлагаемому и известному методам (хромоген — гваякол) дано в табл.2.

Усл овия: 50 мМ Aocha т ный буфер, рН 7,0. Концентрация хромогенов

0,25 мМ. перекиси водорода О, 1 мМ, фотоэлектроколориметр ФЭК КФК-?МП о

Э

1 см. Температура 20 С. Пероксидаза хрена ("Реанол", RZ = 0,6) °

5 1636773 6

Та бли ца 2 Формула изобретения

Способ определения пероксидазной активности биологических объектов путем добавления к исследуемой пробе буферного раствора, перекиси водорода и хромогена и инкубации с измерением прироста оптической плот10 ности во времени, о т л и ч а.юшийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве хромогена используют смесь гваякола и и-аминодизтиланилина при концентрации каждого компонента

0,25-0,75 ммоль.

Конечная концентрация пероксидазы, мкг/мл

Ь > б / ми (Гваяколи-аминодиэтиланилин) ф П440/мин (гваякол) !

0,25

0,5

0,75

0,005

0,124

0,251

0,372

0,492

0,834

0,022

0,045

0,066

0,087

0,198

Составитель Н.Гуляева

Редактор Л.Гратилло Техред С.Мигунова Корректор М.Самборская, Заказ 813 Тираж 410 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r,Óæãîðoä, ул. Гагарина, 101