Способ получения бактериального ферментного препарата

 

Изобретение относится к микробиологической и спиртовой промышленности, аименно к способам получения сухого бактериального ферментного препарата, содержащего а -амилазу. Цель изобретения - повышение стабильности активности а -амилазы при хранении. Способ предусматривает сушку культуральной жидкости Bacillus subtilis, содержащей а -амилазу в присутствии наполнителя - стабилизатора, в качестве которго используют муку злаковых, вводимую в культуральную жидкость в соотношении 4; 1, причем муку разделяют на две части в соотношении 1:20, меньшую из которых смешивают с культуральной жидкостью, а большую добавляют перед сушкой. Для обогащения препарата комплексом других ферментов, а именно ^3-глюканазой, целлюлазой, целлобиазой и ксиланазой, перед сушкой в смесь вводят солод в соотношении 1:8 к муке, Сухой препарат обладает высокой активностью и стабильностью. 1 з.п. ф-лы, 5 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (>п5 С 12 N 9/28

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕ ГЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4737273/13 (22) 12,09.89 (46) 30.01.92. Бюл. М 4 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии (72} .А.Устинников, Л.H.Ìåíäåëüñoí, Е.А.Двадцатова. Н.В.Цурикова, Л.И.Нефедова, Н.Н.Сергиенко и С:Н.Рязанов (53) 577.156(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

К 193419, кл. С 12 и 9/28, 1985.

Авторское свидетельство СССР

N 997455, кл. С 12 N 9/34, 1981.

Яровенко В.Л., Кулунянц К.А. и Голгер

Л.И. Производство ферментйых препаратов из грибов и бактерий. М.: Пищевая промышленность, 1970. с.348-391. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА (57) Изобретение относится к микробиологической и спиртовой промышленности, а

Изобретение относится к микробиологической и спиртовой промышленности, а именно к способам получения сухого бактериального ферментного препарата, содержащего а-амилазу.

Известны способы получения сухих ,ферментных препаратов, содержащих комплекс амилолитических ферментов, предусматривающие ультрафильтрацию культуральной жидкости с последующей сушкой полученного концентрата распылением.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения сухого бактериального ферментного препарата, предусматривающий культивирование продуцента. Ж 1708840 А1 именно к способам получения cyxoro бактериального феоментного препарата, содержащего а -амилазу. Цель изобретения — повышение стабильности активности а -амилазы при хранении, Способ предусматривает сушку культуральной жидкости

Baciiius subtilis, содержащей а -амилазу в присутствии наполнителя — стабилизатора, в качестве которго используют муку злаковых, вводимую в культуральную жидкость в соотношении 4:1, причем муку разделяют на две части в соотношении 1:20, меньшую из которых смешивают с культуральной жидкостью, а большую добавляют перед сушкой, Для обогащения препарата комплексом других ферментов, а именно P -ãëþêàíàçoé, целлюлазой, целлобиазой и ксиланазой, перед сушкой в смесь вводят солод в соотношении 1:8 к муке, Сухой препарат обладает высокой активностью и стабильностью.

1 з.п. ф-лы, 5 табл. бактериальной а -амилазы вид à Bacillus

subtilis с последующим концентрированием р культуральной жидкости сушкой в присутствии наполнителя. В качестве наполнителя по известному способу используют NaCI, Недостатком этого способа являются большие потери активности — около 20% от исходной, а также то, что полученный препарат обладает лишь амилолитической активностью, что ограничивает сферу его применения, так как в спиртовой промышленности наряду с амилолитическими ферментами целесообразно использовать целлюлазу, гемицеллюлоазу, ф-глюканазу, а также ксиланазу и пуллуланазу, способствующие расщеплению белков и не1708840 крахмалистых составных частей зерна и картофеля.

Цель изобретения — повышение стабильности активности а-амилазы при хранении, Предлагаемый способ предусматривает сушку культуральной жидкости Bacillus

subtliis, содержащей а-амилазу, в присутствии наполнителя-стабилизатора, в качестDe которого используют муку злаковых, вводимую в кул ьтурал ь ную жидкость в соотношении 4:1, причем муку разделяют на две части в соотношении 1:20, меньшую из которых смешивают с культуральной жидкостью по окончании процесса культивирования, а большую добавляют перед сушкой.

Целесообразно для обогащения культуральной жидкости наряду с амилазой комплексом других ферментов — P-глюконазой, целлюлазой, целлобиазой и ксиланазой— перед сушкой с мукой вводить в культуральную жидкость солод в соотношении 1:8 к муке, Мука в данном случае при сушке препарата играет роль стабилизируюшего компонента, так как содержит ионы Mg и Са а также углеводы в виде крахмала и сахаров.

Мука злаков является богатым источником минеральных веществ (средняя зольность культур составляет 1,24-2,677;), главная час-.ь которых представлена фосфором, калием, кальцием, магнием, железом. Кроме отмеченных выше в зерне имеется целый ряд других элементов: Na, Al, Tl, Мп и др. г+

Катионы таких металлов, как Mg, Na, р+ г;К, Сг, Со оказывают сильное стимулиру|ощее действие на катэлитическую активность фермента.

Ионы кальция в этом эффекте играют определяющую роль, что объясняется особенностями структурного строения молекулы Q-амилазы. Как известно, нэтивная конфигурация полипептидной цепи а-амилазы Вас.subtiils поддерживается водородными связями между ОН-группами тирозина и СООН-группами дикэрбоновых кислот, а также поперечными связями, которые образуются при участии ионов кальция.

Удаление атомов кальция из белка вызывает интенсивное разрушение третичной структуры фермента и его каталитического центра. В присутствии кальция а-амилаза вполне устойчива к экстремальным значе: ниям температуры и рН, обработке мочевиной и воздействию протеаз. Повышение с,держания кальция в реакционной среде предотвращает денатурирующее действие ионов тяжелых металлов, источником которых в производственных условиях могут

55 быть некоторые реактивы, вода, стенки долгоэксплуатируемых ферментэторов.

При введении части муки по окончании процесса выращивания образуется фермент-субстратный комплекс. так как благодаря стабилизирующему действию кальция образуются дополнительные внутримолекулярные связи, так как присоединяющийся к полипептидной цепи Са ион оказывает нэ г+ цепь сильное направленное действие, приводящее к закручиванию, а фермент приобретает соответствующую стабильность.

Этот эффект еще более усиливается при добавлении в культуральную жидкость второй части муки к образовавшемуся ферментсубстратному комплексу. В этом случае стабилизирующее действие на каталитическую активность оказывает, с одной стороны. крахмал как специфичный для а-амилазы субстрат, с другой стороны, — ионы металлов, в частности калия, магния, кальциия.

Стабилизирующий эффект особенно важен в данном случае, поскольку процесс обезвоживания (сушки) смеси происходит при 55 — 60 С, являющейся критической относительно термостабильности а -амилазы

Вас.subtil!s. Таким образом, мука впервые используется по новому назначению — как стабилизатор.

Ферментативная активность препарата возрастает при добавлении солодэ в смесь муки и культурэльной жидкости.

Ферментный комплекст солода представлен такими ферментами, как а-эмилаза, Р-амилаза, декстринэза. Среди ферментов солода важная роль принадлежит также целлюлэзам,. гемицеллюлазам и пектиназам, расщепляющим соответствующие субстрэты при ферментативной обработке сырья до сбрэживаемых сахаров.

При получении укаэанных смесей повышается осмотическое давление, что препятствует развитию посторонней микрофлоры и способствует повышению стабильности получаемого препарата, Таким образом, при введении муки в определенном соотношении и на определенных стадиях в культуральную жидкость повышается стабильность при сушке и хранении препарата. Этот эффект проявляется после введения муки и усиливается введением солодэ, который наряду с а-амилэзой содер>кит комплекс других ферментов.

Пример 1. Осуществляют глубинное культивирование продуцента а-амилазы

Вас subtilis-82 на среде следующего состава, мэс,g,:

Кукурузная мука 9,0

Кукурузный экстракт 2,0

1708840

Мочевина 0,45

Сульфат аммония 0,3

Мел 0,5

Культивирование осуществляли в ферментаторе вместимостью 32 м, коэффициз ентом загрузки 0,5 в течение 48 ч при 35 С и интенсивном перемешивании культуры.

Получаемая культуральиая жидкость в количестве 15 м имеет активность A. -амиз лазы 100 ед/мл, М;ку приготавливают дроблeииe:, аерна до ие менее чем 85%-го прохода через сито с диаметром отверстий 1 мм. Полученную муку . разделяют на две части в соотношении 1:20. К 15 м культуральиой з жидкости с актигностью 100 ед/м,i-добавили 2,8 т мухи, смесь перемешали и выдержали в те ение 10 мин, затем добавили

57,2 т вторую часть муки. Смесь грзиулируют и подвергают сушке при 55ОС в течение 40 мин до влажности 10%.

П р и и е р 2. Процесс культивирования, подготовку и введение муки осуществляли по прчмеру 1, только перед сушкой к смеси культуральной жидкости и муки авели солод в количестве 7,5 т (соотношение муки с солодом 8:1), Все показатели процесса приведены в табл.1 иэ расчета иа 1 м культуральной жидкости.

Г) р и м е р 3. Процесс культивирования и сушки вели по примеру 1, только использовали муку ржаную. Показатели процесса и характеристики готового продукта аналогичны приведенным в примере 1.

il р и м е р 4. Процесс культивирования и сушки вели по примеру 1, только использовали муку ячменную. Показатели процесса и характеристики продукта аналогичны приведенным в примере 1.

Пример 5, Все по примеру 2, только в качестве муки использовали ржаную муку, а в качестве продуцента фермента—

Вас,rneseuter)cus с активностью а-aMmaзы 40 ед/мл культуральной жидкости, Показатели процесса приведены в табл.2.

При использовании кукурузной муки показатели также аналогичны приведенным в примере 1.

В табл.3 приведены показатели актив5 ности до и пЬсле сушки при разоличиых соотношениях муки и культуральной жидкости, В табл.4 приведены показатели ферментативиой активности после различных

10 сооков хранения.

Сухой бактериальный препарат, получаемь;й по предлагаемому способу, обладает высокой стабильностью. Хранение при 25 С в течение 2 мес приводило к потере актив15 ности ферментов лишь на 2 — бф, (табл,4), в дальнейшем темпы падения активности были незначительными и через 4 мес активность препарата составила 88-95% от исходной.

20 В табл.5 представлены данные, демонстрирующие преимущества предлагаемого способа в сравнении с прототипом, Таким образом, предлагаемый сг)особ обеспечивает получение сухого бактериаль25 ного препарата, обладающего высокой фермеитативной активностью.

Формула изобретения

30 1. Способ получения бактериального фермеитиого препарата из культуральной жидкости Bacl))us subtl)is, содержащей а -амилазу путем ее сушки в присутствии наполнителя, отличающийся тем, что, 35 с целью повышения стабильности активности а -амилаэы при хранении, в качестве иаполнителя используют муку злаковых, вводимую в культуральную жидкость в соотношении 4:1, причем муку разделяют на две

40 части в соотношении 1:20, меньшую из которых смешивают с культуральной жидкостью, а оставшуюся вводят в полученную смесь перед сушкой.

2. Способ по и 1, от л и ч а ю щи и с я

45 тем, что перед сушкой в смесь дополнительно вводят солод в соотношении 1:8 к муке.

Таблица 1

Продолжение табл.1

Таблица 2

170884Î

Продолжение табл.2

Таблица 3

Таблица 4

1708840

Табл.ица 5

Составитель З.Шахтимир

Текред М, Моргентал Корректор М.Кучерявая

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 403 TN p3)K Подписное 3НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5